Diagnóstico de laboratorio de la tuberculosis

La tuberculosis es una enfermedad fácil de diagnosticar en las condiciones modernas y gracias a los avances científicos. El diagnóstico de laboratorio de la tuberculosis ocupa un lugar central entre otros métodos de diagnóstico, superado únicamente por los métodos de radiografía.

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Análisis de sangre clínico

En pacientes con tuberculosis, las alteraciones en el análisis de sangre general no son patognomónicas. En las formas de tuberculosis limitada y de baja actividad, es característica la hipocromía de eritrocitos con un número normal. En infiltrados masivos o neumonía caseosa, con linfadenitis caseosa generalizada, daño intestinal específico, así como con hemorragias pulmonares o postoperatorias extensas, se observan eritropenia y microcitosis, oligocromasia y policromasia. La macrocitosis, y especialmente la poiquilocitosis, se encuentran con mucha menos frecuencia, generalmente con anemia grave. El número de reticulocitos en la etapa compensada de la tuberculosis varía del 0,1 al 0,6%, en la etapa subcompensada, del 0,6 al 1,0%, y para la etapa descompensada, es característico el 1% de reticulocitos.

En algunos casos de tuberculosis puede observarse leucocitosis moderada (hasta 15 mil leucocitos), con menor frecuencia leucopenia, que ocurre en el 2-7% de los casos en pacientes con formas limitadas y leves del proceso y en el 12,5% en la tuberculosis pulmonar destructiva y progresiva.

Con mayor frecuencia, se producen cambios en la fórmula leucocitaria. Se observa neutrofilia relativa y absoluta, con un desplazamiento moderado de la fórmula leucocitaria hacia la izquierda, hacia los promielocitos. Los mielocitos son muy poco frecuentes en casos de tuberculosis sin complicaciones. Un aumento en el número de neutrófilos con granularidad patológica en el hemograma de un paciente con tuberculosis siempre indica la duración del proceso: en pacientes con tuberculosis grave, casi todos los neutrófilos presentan granularidad patológica. Cuando remite un brote de tuberculosis, el desplazamiento nuclear se normaliza con relativa rapidez. La granularidad patológica de los neutrófilos suele persistir más tiempo que otros cambios en el hemograma.

El contenido de eosinófilos en la sangre periférica también fluctúa según la fase del proceso y el estado alérgico del organismo. Su número disminuye hasta alcanzar la aneosinofilia en brotes graves y prolongados de la enfermedad y, por el contrario, aumenta durante la reabsorción de infiltrados y derrame pleural, así como en las formas tempranas de tuberculosis primaria.

La mayoría de las formas de tuberculosis primaria se acompañan de linfopenia, que a veces se observa durante varios años incluso después de la cicatrización de cambios específicos. La tuberculosis secundaria en la fase aguda, dependiendo de la gravedad del proceso, puede acompañarse de un recuento normal de linfocitos o de linfopenia.

Entre las pruebas para evaluar el proceso tuberculoso, la velocidad de sedimentación globular (VSG) ocupa un lugar especial. Esta velocidad es importante para evaluar la evolución de la tuberculosis e identificar sus formas activas. Un aumento de la VSG indica la presencia de un proceso patológico (infeccioso e inflamatorio, purulento, séptico, hemoblastosis, linfogranulomatosis, etc.) y sirve como indicador de su gravedad, pero unos valores normales de VSG no siempre indican la ausencia de patología. La aceleración de la sedimentación globular se ve facilitada por un aumento del contenido de globulinas, fibrinógeno y colesterol en sangre, y una disminución de la viscosidad sanguínea. La ralentización de la sedimentación globular es característica de las afecciones acompañadas de hemoconcentración, un aumento del contenido de albúminas y ácidos biliares.

El hemograma de los pacientes con tuberculosis cambia durante el tratamiento. Cuanto más eficaz sea la intervención terapéutica, más rápido desaparecerán los cambios hematológicos. Asimismo, debe tenerse en cuenta el efecto de diversos fármacos antibacterianos sobre la hematopoyesis. Estos suelen causar eosinofilia, en algunos casos leucocitosis y, con mayor frecuencia, leucopenia que puede llegar a agranulocitosis y reacción linfo-reticular. La monitorización hematológica sistemática y el análisis correcto de los datos obtenidos son esenciales para evaluar el estado clínico del paciente, la dinámica del proceso y la eficacia del tratamiento.

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Análisis clínico de orina

En caso de tuberculosis del tracto urinario, el análisis de orina es el principal método diagnóstico de laboratorio. Se pueden observar leucocituria, eritrocituria, proteinuria, hipoisostenuria, micobacteriuria tuberculosa y bacteriuria inespecífica.

La leucocituria es el síntoma más común de tuberculosis urinaria antes de la quimioterapia específica y solo está ausente en casos excepcionales, como la obliteración completa de la luz ureteral. La prueba de Nechiporenko (determinación del número de leucocitos en 1 ml de orina) ayuda a evaluar de forma más objetiva el grado de leucocituria en la nefrotuberculosis y, en algunos casos, a detectarla con un análisis de orina general normal. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la leucocituria puede presentarse en pielonefritis aguda y crónica, cistitis, uretritis, cálculos renales y uréteres.

La eritrocituria, al igual que la leucocituria, se considera uno de los signos de laboratorio más comunes de la tuberculosis genitourinaria. La frecuencia de la hematuria depende de la prevalencia del proceso y aumenta a medida que se desarrolla el proceso tuberculoso destructivo en el riñón. La eritrocituria sin leucocituria es más típica de las etapas iniciales de la tuberculosis renal. La hematuria, que predomina sobre la leucocituria, constituye un argumento importante a favor de la tuberculosis renal al diferenciarla de la pielonefritis inespecífica.

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Análisis bioquímico de sangre

En la tuberculosis, los cambios en algunos indicadores bioquímicos dependen principalmente de la fase del proceso, las complicaciones y diversas enfermedades concomitantes. En pacientes con tuberculosis inactiva de los pulmones y otros órganos, las proteínas totales y las fracciones proteicas del suero sanguíneo no se modifican y mantienen su contenido normal.

En las formas agudas de la enfermedad, así como en la exacerbación y progresión de las formas crónicas de la tuberculosis, el coeficiente albúmina-globulina disminuye.

La determinación de bilirrubina directa y total, aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) en suero sanguíneo es de vital importancia para evaluar el estado funcional y el daño orgánico hepático en pacientes con tuberculosis y sus complicaciones. La determinación dinámica del nivel de aminotransferasas en el tratamiento de pacientes con tuberculosis, especialmente en sus formas graves, es un componente obligatorio del examen bioquímico de los pacientes con tuberculosis y se realiza mensualmente.

La evaluación del estado funcional renal incluye la determinación de la creatinina sérica y el cálculo de la tasa de filtración glomerular mediante la fórmula de Cockcroft-Gault. El cálculo de la tasa de filtración glomerular mediante la prueba de Reberg arroja resultados menos precisos.

El objetivo principal de los estudios bioquímicos dinámicos de pacientes con tuberculosis es monitorear el curso del proceso, la detección oportuna de los efectos secundarios de los medicamentos y la corrección adecuada de los trastornos de la homeostasis emergentes.

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Aplicación de métodos de investigación bioquímica en la tuberculosis extrapulmonar

El indicador más informativo se considera el contenido de ácido tuberculoesteárico en fluidos biológicos, sin embargo, su determinación está asociada a dificultades técnicas (la necesidad de utilizar cromatografía de gases y espectrometría de masas).

Resulta prometedor medir la actividad de la adenosina desaminasa, una enzima que se determina en líquidos: sinovial, pericárdico, ascítico o cefalorraquídeo. Los principales productores de adenosina desaminasa son los linfocitos y los monocitos. La determinación de la actividad de la adenosina desaminasa en líquidos biológicos facilita el diagnóstico de sinovitis tuberculosa, tuberculosis ganglionar, meningitis tuberculosa y serositis tuberculosa.

Algunos indicadores bioquímicos, debido a su inespecificidad, se determinan únicamente en fluidos biológicos cercanos a la lesión. La concentración de los indicadores se mide en respuesta a la administración subcutánea o intradérmica de tuberculina (generalmente antes de la administración y 48 y 72 horas después). Posteriormente, se calcula el grado de aumento de la concentración del marcador (en %) en relación con la concentración inicial.

De forma óptima, la actividad de la enzima órgano-específica transamidinasa se determina en orina; su presencia se observa en casos de daño renal de diversos orígenes. El estudio de la transamidinasa solo se justifica en casos de administración subcutánea de tuberculina para exacerbar el proceso inflamatorio local. La actividad de la transamidinasa se determina en orina inicialmente y entre 24 y 72 horas después de la administración de 50 TE de tuberculina. Un aumento de la fermenturia al doble o más permite, en el 82 % de los casos, diferenciar la tuberculosis renal activa de la exacerbación de la pielonefritis crónica.

En caso de tuberculosis de los órganos genitales femeninos, las concentraciones de haptoglobina y malondialdehído en la sangre se determinan bajo las condiciones de la prueba de provocación de la tuberculina. La tuberculina se administra por vía subcutánea a una dosis de 50 TE y se realiza un nuevo estudio bioquímico después de 72 horas. En caso de etiología tuberculosa, el grado de aumento en el nivel de haptoglobina es de al menos el 28%, y el nivel de malondialdehído es del 39% o más. También se utiliza la determinación de la actividad de la adenosina desaminasa en el líquido peritoneal obtenido del fondo de saco de Douglas. La punción se examina de nuevo 72 horas después de la administración intradérmica de tuberculina a dosis de 0,1 TE y 0,01 TE en el área de proyección de los órganos genitales internos en la pared abdominal anterior. Un aumento en la actividad de la adenosina desaminasa del 10% o más en comparación con el valor inicial indica un proceso tuberculoso.

En caso de daño ocular, se examina la reacción focal que se produce en el ojo en respuesta a la estimulación antigénica. En este caso, no es deseable el desarrollo de una respuesta aguda acompañada de una disminución de la función visual. Dado que la evaluación de reacciones focales mínimas suele ser difícil, se recomienda analizar simultáneamente el grado de aumento de la haptoglobina o la adenosina desaminasa en el suero sanguíneo para objetivar la conclusión.

Todos los estudios bioquímicos deben realizarse en combinación con otros métodos.

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Estudio del sistema de coagulación sanguínea.

La relevancia del estudio del estado del sistema de coagulación sanguínea en fisiología se debe a la presencia de hemoptisis o hemorragias pulmonares en varios pacientes con tuberculosis pulmonar, así como a las complicaciones de la hemocoagulación en el tratamiento quirúrgico de la tuberculosis. Además, la hemocoagulación intravascular latente que la acompaña afecta la evolución de la enfermedad y la eficacia de la quimioterapia.

En pacientes con tuberculosis pulmonar con un componente inflamatorio predominantemente exudativo, se observa una disminución de la actividad anticoagulante sanguínea. En pacientes con baja prevalencia de daño pulmonar específico y un componente inflamatorio predominantemente productivo, la hemocoagulación intravascular es insignificante. En pacientes con tuberculosis pulmonar con hemoptisis y hemorragias pulmonares, el estado del sistema de coagulación sanguínea es diferente: en pacientes con pérdida sanguínea leve, en el momento álgido de la hemoptisis o inmediatamente después de su cese, se observa un aumento significativo de la capacidad de coagulación sanguínea debido a una intensificación pronunciada de los procesos de formación de trombina, manteniendo al mismo tiempo una coagulabilidad estructural elevada. En pacientes con pérdida sanguínea masiva, se observa una disminución del potencial de coagulación debido a una disminución de la concentración de fibrinógeno, la actividad del factor XIII y el recuento de plaquetas. Durante el tratamiento quirúrgico, en pacientes con formas limitadas de tuberculosis pulmonar, no se producen alteraciones significativas en el sistema de homeostasis. En pacientes con procesos generalizados, al realizar una neumonectomía o pleuroneumonectomía, a menudo se desarrolla un síndrome CID, que puede adoptar la forma de una “segunda enfermedad”.

Para monitorear el estado del sistema de coagulación sanguínea en pacientes con tuberculosis pulmonar, es necesario determinar el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), el fibrinógeno, el tiempo de trombina, el índice de protrombina, así como el tiempo de sangrado y el tiempo de coagulación sanguínea.

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Estudios hormonales

Observaciones experimentales y clínicas modernas indican la presencia de cambios en el estado hormonal en casos específicos de inflamación tuberculosa pulmonar. Se ha demostrado que la corrección de la disfunción de los sistemas hipófisis-suprarrenal e hipófisis-tiroideo, así como de la función pancreática, en combinación con la terapia antituberculosa, contribuye a la activación de la fibrogénesis y los procesos de reparación en el foco de inflamación específico.

El estado funcional del sistema hipofisario-tiroideo se evalúa mediante el contenido sérico de triyodotironina (T3), tiroxina (T4) y hormona estimulante de la tiroides (TSH) _. Se _ha establecido que el hipotiroidismo subclínico se detecta en el 38-45% de los pacientes con tuberculosis pulmonar, y se diagnostica con mayor frecuencia en las formas diseminada y fibrocavernosa del proceso. En estas formas, los niveles de T3 y T4 están más reducidos _, y se produce _un desequilibrio de estas hormonas en forma de un aumento de la _{relación T4/} T3.

La función de la corteza suprarrenal se evalúa mediante el nivel sérico de cortisol, y la función endocrina del páncreas se evalúa mediante la concentración de insulina inmunorreactiva. En la fase aguda de una enfermedad infecciosa, aumenta la necesidad de cortisol e insulina endógenos. La hiperinsulinemia también indica resistencia a la insulina de los tejidos corporales, lo cual es típico de cualquier proceso inflamatorio activo, en particular uno específico. La determinación de la función glucocorticoide de las glándulas suprarrenales en la tuberculosis pulmonar activa permite detectar la presencia de hipercorticismo en la mayoría de los pacientes. Las concentraciones normales de cortisol en sangre en un paciente con inflamación infecciosa en el período agudo deben considerarse como una insuficiencia relativa de la función glucocorticoide de la corteza suprarrenal, que puede servir como base para la terapia de reemplazo con dosis adecuadas de glucocorticoides.

Casi un tercio de los pacientes con tuberculosis pulmonar presentan niveles bajos de insulinemia, cercanos al límite inferior de la norma, mientras que entre el 13 % y el 20 % presentan hiperinsulinismo significativo. Tanto el hipoinsulinismo relativo como el hiperinsulinismo son factores de alto riesgo para el desarrollo de trastornos del metabolismo de los carbohidratos de diversa gravedad. Estos cambios en la actividad funcional de las células B pancreáticas requieren un control regular de la glucemia en pacientes con tuberculosis y la prevención oportuna de la diabetes mellitus. Además, esto justifica la pertinencia del uso de dosis fisiológicas de insulina en el tratamiento complejo de la tuberculosis.

En general, la disminución de los niveles de hormona tiroidea, su desequilibrio, la hipercortisolemia y el hiperinsulinismo son más pronunciados en pacientes con un curso grave del proceso tuberculoso, con lesiones pulmonares extensas y síntomas pronunciados de intoxicación tuberculosa.

Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

Los estudios microbiológicos son necesarios para identificar a los pacientes con tuberculosis, verificar el diagnóstico, controlar y corregir la quimioterapia, evaluar los resultados del tratamiento, es decir, desde el momento en que se registra a un paciente con tuberculosis hasta que se le da de baja del registro.

Todos los programas y proyectos epidemiológicos se basan en la evaluación del número de excretores de bacterias, lo cual es imposible sin el uso de métodos de laboratorio para la detección de micobacterias de la tuberculosis. Al examinar la población desorganizada, el porcentaje de excretores de bacterias alcanza el 70% o más, lo que convierte a los métodos de laboratorio en un método bastante eficaz para identificar a los pacientes con tuberculosis en este grupo de población.

Los métodos microbiológicos tradicionales para el diagnóstico de la tuberculosis son los estudios bacterioscópicos y de cultivo. Los métodos modernos incluyen el cultivo de micobacterias de la tuberculosis en sistemas automatizados y la PCR. Sin embargo, todos estos métodos se combinan necesariamente con los métodos bacteriológicos clásicos.

Colección de material de diagnóstico

La eficacia de las pruebas de laboratorio depende en gran medida de la calidad del material diagnóstico. El cumplimiento de las normas de recolección, almacenamiento y transporte de material diagnóstico, así como la correcta implementación del algoritmo de examen del paciente, influyen directamente en el resultado y garantizan la seguridad biológica.

Se utilizan diversos materiales para detectar la tuberculosis. Dado que la tuberculosis pulmonar es la forma más común de infección tuberculosa, el principal material de prueba es el esputo y otros tipos de secreciones del árbol traqueobronquial: secreciones de las vías respiratorias superiores obtenidas tras inhalaciones de aerosoles; aguas de lavado bronquial; lavados broncoalveolares; material obtenido durante broncoscopias, biopsias transtraqueales e intrapulmonares: aspirado bronquial, frotis laríngeo, exudados, frotis de heridas, etc.

La eficacia de la investigación aumenta si se lleva a cabo una recolección controlada de material del paciente. Para ello, se asigna una sala especialmente equipada o se adquieren cabinas especiales. La recolección de material es un procedimiento peligroso, por lo que el material para la investigación debe recolectarse cumpliendo con las normas de seguridad contra infecciones.

El material para la prueba de Mycobacterium tuberculosis se recoge en viales estériles con tapones bien cerrados para evitar la contaminación del medio ambiente y proteger el material recogido de la contaminación.

Los viales para la recogida de material diagnóstico deberán cumplir los siguientes requisitos:

• debe estar hecho de material resistente a los impactos;
• debe derretirse fácilmente al esterilizarlo en autoclave;
• tener un volumen suficiente (40-50 ml):
• tener una abertura amplia para recoger el esputo (diámetro no inferior a 30 mm);
• ser de fácil manejo, transparente o translúcido, de modo que se pueda evaluar la cantidad y calidad de la muestra recogida sin abrir la tapa.

Para obtener resultados óptimos de investigación, se deben cumplir las siguientes condiciones:

• La recolección de material debe realizarse antes del inicio de la quimioterapia;
• El material para el estudio debe ser recogido antes de comer o tomar medicamentos por la mañana;
• Para el estudio, se recomienda recolectar al menos tres muestras de esputo matutino. El esputo se recolecta durante tres días consecutivos.
• El material recolectado deberá ser entregado al laboratorio lo más rápidamente posible:
• en los casos en que sea imposible entregar el material al laboratorio inmediatamente, se conserva en refrigerador a una temperatura del aire de 4 °C durante no más de 48 horas;
• Al transportar el material es necesario prestar especial atención a la integridad de las botellas.

El esputo correctamente recolectado presenta características mucosas o mucopurulentas. El volumen óptimo de la porción de esputo examinada es de 3 a 5 ml.

La recolección de esputo se realiza bajo la supervisión de un profesional sanitario. Las personas responsables de la recolección de esputo deben garantizar el cumplimiento de ciertas normas:

• Es necesario explicar al paciente el propósito del examen y la necesidad de expectorar, no saliva ni moco nasofaríngeo, sino el contenido de las vías respiratorias profundas. Esto puede lograrse mediante una tos productiva que se presenta tras varias (2-3) respiraciones profundas. También es necesario advertirle que primero debe enjuagarse la boca con agua hervida para eliminar la mayor parte de la microflora que vegeta en la cavidad oral y los restos de comida que dificultan el examen del esputo.
• El personal médico que participe en la recolección de esputo, además de bata y gorro, deberá utilizar mascarilla, guantes de goma y delantal de goma;
• De pie detrás del paciente, se le aconseja sostener el frasco lo más cerca posible de sus labios y separar inmediatamente el esputo en él mientras lo tose, mientras que es necesario asegurar que el flujo de aire se dirija lejos del trabajador de la salud:
• Una vez finalizada la recolección de esputo, el profesional sanitario debe cerrar cuidadosamente el frasco con la tapa y evaluar la cantidad y calidad del esputo recolectado. Posteriormente, el frasco se etiqueta y se coloca en una caja especial para su transporte al laboratorio.

Si el paciente no produce esputo, la noche anterior y a primera hora de la mañana del día de la recolección, se le debe administrar un expectorante: extracto de raíz de malvavisco (mucaltin), bromhexina, ambroxol, etc., o bien, se le debe administrar una inhalación irritante utilizando el equipo instalado en la sala de recolección de esputo. El material recolectado de esta manera no se puede conservar y debe examinarse el día de la recolección. Para evitar su rechazo en el laboratorio, se debe incluir una nota especial en la derivación.

Si no se realizan estudios microbiológicos en una institución determinada, el material de diagnóstico recolectado debe entregarse al laboratorio central, siempre que se conserve refrigerado o con conservantes entre entregas. El material se entrega al laboratorio en cajas de transporte fáciles de desinfectar. Cada muestra debe estar etiquetada y el lote completo debe ir acompañado de un formulario completo.

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Modos y frecuencia de examen de los pacientes

Durante el examen inicial, llamado diagnóstico, de un paciente para tuberculosis, es necesario examinar al menos 3 porciones de esputo recolectadas bajo la supervisión de personal médico en el transcurso de 2 o 3 días, lo que aumenta la efectividad de la microscopía.

La detección primaria de la tuberculosis debe ser realizada por todas las instituciones médicas y de diagnóstico del sistema de salud. Recientemente, para aumentar la eficacia de la detección primaria, se han organizado centros de microscopía basados en laboratorios de diagnóstico clínico, equipados con microscopios y equipos modernos para garantizar la seguridad epidémica.

Las instituciones antituberculosas utilizan un programa de encuesta que contempla al menos tres exámenes de esputo u otro material de diagnóstico en un plazo de tres días. Durante el tratamiento, se realizan estudios microbiológicos con regularidad, al menos una vez al mes, durante la fase de quimioterapia intensiva. Al pasar a la fase de seguimiento, los estudios se realizan con menor frecuencia, a intervalos de dos a tres meses, y la frecuencia de los estudios se reduce a dos.

Características de la recolección de material diagnóstico para la tuberculosis extrapulmonar

Una característica del material patológico en las formas extrapulmonares de tuberculosis es la baja concentración de micobacterias tuberculosis en él, lo que requiere métodos de investigación microbiológica más sensibles, principalmente métodos de siembra en un medio nutritivo.

En caso de tuberculosis genitourinaria, la orina es el material más accesible para el análisis. La recolección de orina debe ser realizada por un enfermero especializado.

Los genitales externos se lavan con agua y jabón o una solución diluida de permanganato de potasio. La abertura uretral se limpia cuidadosamente. La porción media de la orina matutina se recoge en una botella estéril: en los hombres, naturalmente, y en las mujeres, mediante un catéter. La orina de la pelvis renal se recoge en tubos de ensayo estériles durante el cateterismo de uno o dos riñones; en este último caso, siempre por separado de cada riñón. Se centrifuga una pequeña cantidad de esta orina y se examina el sedimento.

En los hombres, el esperma, las punciones testiculares y las secreciones prostáticas se centrifugan para obtener un sedimento. Ante cualquier localización de un proceso específico en la zona genital masculina, el masaje prostático puede promover la liberación de secreciones que contienen micobacterias de la tuberculosis.

La sangre menstrual se recolecta de las mujeres mediante succión o con un capuchón de Kafka. El material resultante se separa de los eritrocitos lavándolo con agua destilada y centrifugándolo. Se examina el sedimento.

La secreción del canal cervical del útero se recoge en algún recipiente o gorro de Kafka, es decir, es deseable acumular 1-2 ml de material patológico.

El material obtenido durante intervenciones quirúrgicas en riñones, genitales, biopsias y raspados endometriales se homogeneiza. Para ello, se coloca en un mortero estéril y se tritura completamente con tijeras estériles. A la suspensión resultante se le añade arena de río estéril en una cantidad equivalente a su masa, luego se añaden 0,5-1,0 ml de solución isotónica de cloruro de sodio y se tritura hasta obtener una masa pastosa con la adición de solución isotónica de cloruro de sodio (4-5 ml). A continuación, se deja reposar la masa durante 1-1,5 minutos y se examina el sobrenadante.

Tuberculosis de huesos y articulaciones. La punción (pus de abscesos) obtenida con una jeringa estéril se coloca en un recipiente estéril y se envía inmediatamente al laboratorio. Con una pipeta estéril, previamente humedecida con solución isotónica estéril de cloruro de sodio, se extraen de 2 a 5 ml de pus, se transfieren a un frasco con microesferas y se añaden otros 2 a 3 ml de solución isotónica de cloruro de sodio. El frasco se tapa con un tapón y se agita en un agitador durante 8 a 10 minutos. Se examina la suspensión homogeneizada.

En las formas fistulosas de tuberculosis osteoarticular, se extrae pus de la fístula. La secreción abundante se recoge directamente en un tubo de ensayo. En caso de secreción escasa, se lava el trayecto fistuloso con una solución isotónica estéril de cloruro de sodio, y las muestras recogidas en un tubo de ensayo o un tampón empapado en pus se envían para su análisis.

El material quirúrgico obtenido durante intervenciones quirúrgicas en huesos y articulaciones puede consistir en masas purulentas-necróticas, granulaciones, tejido cicatricial, tejido óseo, tejido sinovial y otros sustratos. Su procesamiento se realiza como en el caso de la tuberculosis renal.

Se realiza inmediatamente después de la punción un examen microbiológico del líquido sinovial en una solución de citrato de sodio al 3% (en una proporción 1:1) para prevenir la coagulación.

Tuberculosis ganglionar. El pus extraído durante la punción ganglionar se examina de la misma manera que el pus de los abscesos. El tejido ganglionar obtenido durante intervenciones quirúrgicas y biopsias se examina como en otras formas de tuberculosis.

El estudio de heces para Mycobacterium tuberculosis se realiza muy raramente debido a la casi completa ausencia de resultados positivos.

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Microscopía de micobacterias

La microscopía de esputo es un método relativamente rápido, sencillo y económico que debe utilizarse en todos los casos de sospecha de tuberculosis. Además, este estudio se realiza para evaluar la eficacia de la quimioterapia y confirmar la recuperación o el fracaso del tratamiento en ausencia de resultados de cultivo.

Se utilizan dos métodos de examen microscópico:

• método de microscopía directa, cuando se prepara un frotis directamente del material de diagnóstico;
• un método de microscopía de sedimento preparado a partir de material tratado con descontaminantes para investigación cultural.

El primer método se utiliza en aquellos laboratorios donde sólo se realizan estudios microscópicos (laboratorios de diagnóstico clínico de la red médica general).

Los mejores resultados del examen microscópico se obtienen concentrando el material de diagnóstico (por ejemplo, mediante centrifugación).

Para detectar Mycobacterium tuberculosis con una probabilidad del 50 % mediante microscopía, 1 ml de esputo debe contener más de 5000 células microbianas. El esputo de pacientes con formas pulmonares de tuberculosis suele contener una cantidad significativa de bacterias acidorresistentes, lo que permite detectarlas con fiabilidad mediante bacterioscopia. La sensibilidad diagnóstica de este método puede aumentarse examinando varias muestras de esputo de un mismo paciente. Un resultado negativo en la bacterioscopia no descarta el diagnóstico de tuberculosis, ya que el esputo de algunos pacientes contiene menos Mycobacterium de lo que se puede detectar mediante microscopía. Una preparación deficiente de los frotis de esputo también puede ser la causa de un resultado negativo en la bacterioscopia.

El método más común para detectar micobacterias acidorresistentes en un frotis es la tinción de Ziehl-Neelsen. Este método se basa en la penetración de la fucsina carbol en una célula microbiana a través de una membrana que incluye una capa lipídica y cerosa, con el efecto simultáneo del calor y la potente acción grabadora del fenol. La posterior decoloración del frotis con una solución de ácido sulfúrico al 25 % o alcohol clorhídrico al 3 % produce la decoloración de todas las estructuras no acidorresistentes. Los elementos decolorados del frotis se tiñen con una solución de azul de metileno al 0,3 %. Las micobacterias no perciben los colorantes de anilina convencionales, por lo que las micobacterias acidorresistentes se tiñen de rojo frambuesa, mientras que otros microbios y elementos celulares se tiñen de azul.

Para examinar frotis teñidos según la técnica de Ziehl-Neelsen, utilice un microscopio binocular óptico con objetivo de inmersión (90 o 100 aumentos) y un ocular con 7 o 10 aumentos. Se examinan 100 campos de visión, suficientes para detectar una sola micobacteria en el frotis. Si el resultado de este examen es negativo, se recomienda examinar otros 200 campos de visión para confirmarlo. Los resultados se registran, indicando el número de micobacterias acidoalcohol resistentes (BAAR) detectadas.

Además de este método, la tinción con fluorocromo se utiliza para la microscopía luminiscente, lo que permite lograr los mejores resultados. El uso de este método aumenta la eficiencia de la microscopía en un 10-15%. Cuando las micobacterias se tratan con colorantes luminiscentes (auramina, rodamina, etc.), estas sustancias también se unen a las estructuras cerosas de la célula microbiana. Cuando las células teñidas se irradian con una fuente de luz excitante (un cierto espectro de radiación ultravioleta), comienzan a brillar en naranja o rojo brillante contra un fondo negro o verde oscuro. Debido al alto brillo y contraste de la imagen visible, el aumento total del microscopio se puede reducir de 4 a 10 veces, lo que amplía el campo de visión y reduce el tiempo de visualización de la preparación. Junto con esto, debido a la profundidad de campo significativamente mayor, se puede aumentar la comodidad del estudio.

Al utilizar la microscopía de fluorescencia, la visualización de la misma área de un frotis requiere mucho menos tiempo que la microscopía óptica de frotis teñidos según el método de Ziehl-Neelsen. Si un microscopista examina aproximadamente entre 20 y 25 frotis de este tipo durante una jornada laboral, con la ayuda de la microscopía de fluorescencia puede examinar más de 60 a 80 muestras simultáneamente. Los microscopistas experimentados saben que la tinción de células con una mezcla de auramina y rodamina es específica para las micobacterias acidorresistentes, que en este caso presentan la apariencia de bastoncillos de oro. Los saprofitos se tiñen de color verdoso.

Otra ventaja importante del método de microscopía de fluorescencia es la capacidad de detectar micobacterias alteradas que han perdido sus propiedades de resistencia al ácido bajo la influencia de una serie de factores desfavorables, en particular la quimioterapia intensiva, y por lo tanto no se detectan mediante la tinción de Ziehl-Neelsen.

Las desventajas del método de microscopía de fluorescencia incluyen el costo relativamente alto del microscopio y su operación. Sin embargo, en laboratorios centralizados o de gran tamaño, donde la carga de trabajo excede la norma de tres técnicos de laboratorio trabajando con tres microscopios convencionales, resulta más económico utilizar un solo microscopio de fluorescencia.

Los métodos bacterioscópicos presentan una especificidad bastante alta (89-100%). Aproximadamente el 97 % de los resultados positivos obtenidos con cualquier método microscópico se confirman claramente mediante los resultados de la siembra.

Cabe señalar que el examen microscópico de un frotis de material patológico no permite determinar la especie de las micobacterias resistentes al ácido detectadas. El método microscópico solo permite concluir sobre la presencia o ausencia de microorganismos resistentes al ácido en la preparación, lo cual se explica por la existencia en la naturaleza de un gran número de microorganismos resistentes al ácido no tuberculosos, morfológicamente similares a las micobacterias del complejo tuberculoso.

La evaluación de los resultados de la microscopía se realiza en unidades semicuantitativas.

Para comparar los resultados de diferentes métodos de microscopía, se introducen coeficientes empíricos. Por ejemplo, para comparar los resultados de un frotis teñido con colorantes fluorescentes con los datos de un estudio de microscopía óptica (1000 aumentos), es necesario dividir el número de micobacterias acidorresistentes detectadas con un microscopio de fluorescencia por el coeficiente correspondiente: a 250 aumentos, por 10; a 450, por 4; y a 630, por 2.

Características de la microscopía en la tuberculosis extrapulmonar

Se realiza microscopía directa, así como microscopía de frotis preparados tras el enriquecimiento con tinción posterior de Ziehl-Neelsen o colorantes fluorescentes. La microscopía directa de frotis resulta ineficaz debido a la baja concentración de micobacterias en el material, por lo que resulta más racional utilizar métodos de enriquecimiento. La centrifugación es el método más eficaz. Si el material biológico es viscoso, se utiliza la centrifugación con homogeneización y licuefacción simultáneas del material, lo cual se lleva a cabo utilizando centrífugas de alta velocidad con una fuerza de centrifugación de 3000 g y soluciones de hipoclorito. Otros métodos de enriquecimiento, como la microflotación, no se utilizan actualmente debido a la formación de aerosoles biológicamente peligrosos.

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Método de cultivo para el diagnóstico de la tuberculosis

El método de siembra, o método de cultivo, es más sensible que la baciloscopia y presenta varias ventajas. Permite detectar varias docenas de micobacterias viables en el material examinado y tiene un alto valor diagnóstico. Esto es especialmente importante al examinar material de pacientes recién diagnosticados o tratados que excretan una pequeña cantidad de micobacterias.

En comparación con la microscopía, la investigación con cultivos permite aumentar el número de pacientes con tuberculosis detectados en más de un 15-25%, así como verificar la tuberculosis en etapas tempranas, cuando la enfermedad aún es fácilmente tratable. Una ventaja muy importante de la investigación con cultivos es la posibilidad de obtener un cultivo de patógenos, que puede identificarse y estudiarse en relación con la sensibilidad a fármacos, la virulencia y otras propiedades biológicas.

Las desventajas de los métodos de cultivo incluyen su duración (el período de espera para los materiales alcanza las 10 semanas), mayor costo y la complejidad del procesamiento del material de diagnóstico.

Principios del tratamiento previo a la siembra del material de diagnóstico

Los métodos microbiológicos convencionales no permiten realizar pruebas de tuberculosis. Esto se debe a que las micobacterias de la tuberculosis crecen muy lentamente y la mayoría de las muestras clínicas contienen microorganismos y hongos piógenos y putrefactos de rápido crecimiento. Su rápido crecimiento en medios ricos en nutrientes interfiere con el desarrollo de las micobacterias e impide el aislamiento del patógeno de la tuberculosis, por lo que el material de diagnóstico debe pretratarse antes de la siembra. Además, las micobacterias liberadas por las vías respiratorias del paciente suelen estar rodeadas de una gran cantidad de moco, lo que dificulta su concentración. Por ello, antes de sembrar el esputo y otros materiales similares, estos deben licuarse y descontaminarse.

Todos los detergentes y descontaminantes tienen un efecto tóxico más o menos pronunciado sobre las micobacterias. Como resultado del tratamiento, hasta el 90% de las micobacterias pueden morir. Para preservar una proporción suficiente de la población micobacteriana, es necesario utilizar métodos de tratamiento suaves que permitan, por un lado, suprimir los microorganismos piógenos y putrefactos de rápido crecimiento y, por otro, preservar al máximo la viabilidad de las micobacterias presentes en el material.

Dependiendo del material, su homogeneidad y nivel de contaminación, se utilizan diversos descontaminantes para el tratamiento previo a la siembra: para esputo: solución de hidróxido de sodio al 4%, soluciones de fosfato trisódico al 10%, cloruro de benzalconio fosfato trisódico, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteína-hidróxido de sodio) con una concentración final de NaOH del 1%, para orina y otros materiales líquidos: solución de ácido sulfúrico al 3%, para muestras contaminadas, materiales que contienen grasa: solución de ácido oxálico hasta el 5%. Además, en algunos casos, se utilizan enzimas y surfactantes (detergentes). El uso de Tween y algunos otros detergentes se acompaña de una menor muerte de células micobacterianas (sobrevive entre el 40 y el 50%). Sin embargo, solo se pueden utilizar para materiales líquidos. NALC-NaOH, producido en kits, es el más utilizado en el mundo. Este método permite aislar más del 85% de la población celular micobacteriana. La descontaminación de materiales sólidos que contienen tejido es más difícil, ya que es difícil estimar el grado de dispersión del material durante la homogeneización. Por ejemplo, el procesamiento de biopsias de ganglios linfáticos suele ir acompañado de una mayor frecuencia de contaminación con flora extraña. En este caso, se puede utilizar etonio al 1%.

El material no homogéneo se homogeneiza mediante microesferas de vidrio en presencia de descontaminantes. Los materiales líquidos se precentrifugan y solo se procesa el sedimento.

Técnica de siembra e incubación

Tras el procesamiento preliminar, el material se centrifuga, lo que precipita las micobacterias y aumenta su contenido en el sedimento («enriquecimiento del sedimento»). El sedimento resultante se neutraliza y se inocula en la superficie de medios nutritivos densos o tubos de ensayo con medios líquidos (semilíquidos). A partir del sedimento restante se preparan frotis para examen microscópico. La técnica de siembra debe evitar la contaminación cruzada del material de diagnóstico.

Para una interpretación clínica fiable de los resultados de la investigación microbiológica, se debe observar la siguiente regla: los estudios microscópicos y de cultivo deben realizarse en paralelo a partir de la misma muestra de material de diagnóstico.

Los tubos inoculados se colocan en un termostato a 37 ^° C durante dos días en posición horizontal. Esto garantiza una absorción más uniforme del material en el medio nutritivo. Después de dos días, los tubos se colocan en posición vertical y se sellan herméticamente con tapones de goma o silicona para evitar que el medio sembrado se seque.

Los cultivos se mantienen en un termostato a 37 ^° C durante 10 a 12 semanas, con inspecciones semanales regulares. En cada inspección de control se registran los siguientes parámetros:

• período de crecimiento observable visualmente desde el día de la siembra;
• tasa de crecimiento (número de UFC);
• contaminación del cultivo con flora microbiana extraña o con hongos (dichos tubos de ensayo se retiran);
• No hay crecimiento visible. Los tubos se dejan en el termostato hasta la próxima inspección.

Medios nutritivos

Se utilizan diversos medios nutritivos para el cultivo de micobacterias: sólidos, semilíquidos y líquidos. Sin embargo, ninguno de los medios nutritivos conocidos garantiza el crecimiento de todas las células micobacterianas. Por ello, para mejorar la eficiencia, se recomienda utilizar simultáneamente de 2 a 3 medios nutritivos de diferentes composiciones.

Como medio estándar para el aislamiento primario del patógeno de la tuberculosis y la determinación de su sensibilidad a los fármacos, la OMS recomienda el medio de Lowenstein-Jensen. Este es un medio denso para huevos en el que se obtiene el crecimiento de micobacterias entre los días 20 y 25 después de sembrar material bacterioscópicamente positivo. La siembra de material bacterioscópicamente negativo requiere un periodo de incubación más largo (hasta 10-12 semanas).

En nuestro país, el medio de cultivo para huevos Finn-II, propuesto por ER Finn, se ha generalizado. Se diferencia en que, en lugar de L-asparagina, utiliza glutamato sódico, que activa otras vías de síntesis de aminoácidos en las micobacterias. El crecimiento en este medio se produce algo antes, y la frecuencia de aislamiento de micobacterias es entre un 6 % y un 8 % mayor que en el medio de Lowenstein-Jensen.

Para aumentar la eficiencia del diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis extrapulmonar, se recomienda incluir medios Finn-II modificados en el complejo de medios nutritivos. Para acelerar el crecimiento, se añade tioglicolato de sodio al 0,05 % al medio nutritivo Finn-II, lo que reduce la concentración de oxígeno. Para proteger los sistemas enzimáticos de las micobacterias de los productos tóxicos de la peroxidación lipídica, se introduce el antioxidante acetato de α-tocoferol en el medio nutritivo Finn-II a una concentración de 0,001 μg/ml. El material de diagnóstico se siembra mediante el método estándar.

En los laboratorios antituberculosos de Rusia también se utilizan otras modificaciones de medios nutritivos densos: el medio nutritivo "Novaya" propuesto por G. G. Mordovsky, los medios nutritivos A-6 y A-9 desarrollados por V. Anikin, etc.

Debido a que durante la quimioterapia se producen daños en varios sistemas metabólicos de la célula microbiana, una parte de la población micobacteriana pierde la capacidad de desarrollarse normalmente en medios nutritivos convencionales y requiere medios nutritivos osmóticamente equilibrados (semilíquidos o líquidos).

Evaluación y registro de los resultados del cultivo de material diagnóstico

Algunas cepas y tipos de micobacterias crecen lentamente; el crecimiento puede aparecer incluso hacia el día 90. El número de estos cultivos es pequeño, pero esto obliga a mantener las siembras en un termostato durante 2,5 a 3 meses.

Los cultivos virulentos de Mycobacterium tuberculosis suelen crecer en medios sólidos de huevo como colonias de forma R de tamaño y apariencia variables. Las colonias son secas, arrugadas, de color marfil y ligeramente pigmentadas. En otros medios, las colonias de Mycobacterium tuberculosis pueden ser más húmedas. Después de un ciclo de quimioterapia o durante el tratamiento, se pueden aislar colonias lisas con crecimiento húmedo (formas S).

Durante el aislamiento de cultivos se utiliza un conjunto de estudios especiales para distinguir las micobacterias tuberculosas de las micobacterias no tuberculosas y de los saprófitos ácido-alcohol resistentes.

Se obtiene una respuesta positiva tras el examen microscópico obligatorio de un frotis de las colonias cultivadas, teñido según la técnica de Ziehl-Neelsen. En caso de crecimiento de micobacterias, se observan bacilos rojos brillantes en los frotis, ya sea individualmente o en grupos, formando racimos en forma de fieltro o trenzas. En cultivos jóvenes, especialmente en los aislados de pacientes tratados con quimioterapia durante un tiempo prolongado, las micobacterias se distinguen por un polimorfismo pronunciado, que incluye variantes cortas, casi cocoides o alargadas, similares al micelio fúngico, junto con formas en forma de bacilo.

La intensidad del crecimiento micobacteriano se designa según el siguiente esquema: (+) - 1-20 UFC en un tubo de ensayo (baja excreción bacteriana); (++) - 20-100 UFC en un tubo de ensayo (excreción bacteriana moderada); (+++) - >100 UFC en un tubo de ensayo (excreción bacteriana abundante). En el diagnóstico de laboratorio de la tuberculosis, no basta con indicar si se han detectado o no micobacterias mediante un método específico. También es necesario tener una idea detallada del volumen y la naturaleza de la población micobacteriana, su composición y propiedades. Estos datos permiten interpretar correctamente el estado del proceso, planificar las tácticas y ajustar el tratamiento con prontitud.

En los últimos años, se han propuesto medios nutritivos a base de agar con diversos aditivos de crecimiento y el uso de una mezcla especial de gases para acelerar el crecimiento de las micobacterias. Para lograr el crecimiento de las micobacterias en estos medios, se crea una atmósfera con un alto contenido de dióxido de carbono (4-7%) durante el cultivo. Para ello, se utilizan incubadoras especiales de CO₂ _. Sin embargo, los sistemas automatizados de cultivo de micobacterias han experimentado el mayor desarrollo: MGIT-BACTEC-960 y MB/Bact.

Uno de estos sistemas es el MGIT (tubo indicador de crecimiento de micobacterias), un desarrollo de alta tecnología diseñado para el diagnóstico bacteriológico acelerado de la tuberculosis y la determinación de la sensibilidad de las micobacterias a los fármacos de primera y segunda línea. El MGIT está diseñado para su uso como parte del dispositivo VASTEC-960. Los microorganismos se cultivan en tubos de ensayo especiales con un medio nutritivo líquido basado en un medio Middlebrook-7H9 modificado. Para estimular el crecimiento de micobacterias e inhibir el crecimiento de microflora extraña, se utiliza el suplemento de crecimiento MGIT y una mezcla de fármacos antibacterianos PANTA.

El crecimiento de los microorganismos se registra ópticamente. Se basa en la fluorescencia, que se produce cuando las micobacterias consumen oxígeno durante su crecimiento. Un colorante fluorocromo dependiente del oxígeno se encuentra en el fondo de un tubo de ensayo especial, recubierto con una capa de silicona. La reproducción de las micobacterias provoca una disminución de la cantidad de oxígeno en el tubo de ensayo y una disminución de su concentración, lo que provoca un aumento de la fluorescencia, visible al irradiarlo con luz ultravioleta. Esta se registra automáticamente mediante fotosensores integrados en el dispositivo VASTES-960. La intensidad de la luminiscencia se registra en unidades de crecimiento (UG). Los datos de crecimiento se introducen automáticamente en un ordenador, donde pueden guardarse. El análisis informático de las curvas de crecimiento puede proporcionar información sobre la presencia de diversos grupos de micobacterias, incluidas las no tuberculosas, y también ayuda a evaluar las propiedades de crecimiento de las micobacterias.

Gracias a la introducción de estos sistemas, el tiempo de crecimiento de las micobacterias se ha reducido significativamente, alcanzando un promedio de 11 días en VASTEC-960 y 19 días en MB/Bact, frente a los 33 días en un medio nutritivo denso estándar. Cabe destacar que estos sistemas requieren personal altamente cualificado. La siembra del material en medios líquidos se acompaña necesariamente de la siembra en el medio de Lowenstein-Jensen, que actúa como respaldo en los casos en que las micobacterias de la tuberculosis no crecen en otros medios.

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Determinación de la susceptibilidad de las micobacterias a los fármacos

La determinación del espectro y el grado de sensibilidad de las micobacterias a los fármacos antituberculosos es de gran importancia clínica, así como para la evaluación epidemiológica de la propagación de la tuberculosis farmacorresistente. Además, el monitoreo de la farmacorresistencia permite evaluar la eficacia del programa antituberculoso en su conjunto, siendo un indicador integral del funcionamiento de todos los componentes de las medidas antituberculosas.

Frecuencia y momento de las pruebas de sensibilidad a los medicamentos:

• Antes de iniciar el tratamiento, una vez para determinar la estrategia y las tácticas del tratamiento:
• Al aislar cultivos de diversos materiales de un paciente (esputo, BAL, orina, exudados, líquido cefalorraquídeo, etc.), se examinan todas las cepas aisladas:
• Al final de la fase intensiva del tratamiento en ausencia de dinámica clínica y radiológica:
• si es necesario cambiar el régimen de tratamiento en caso de:
  • ausencia de negatividad del esputo;
  • recultivo después de negatividad del esputo;
  • Un aumento brusco de la cantidad de BAAR en un frotis tras una disminución inicial. Es bien sabido que se aíslan cepas de Mycobacterium tuberculosis con diferente sensibilidad a los fármacos a partir de material de un paciente con tuberculosis. La sensibilidad de las cepas a los fármacos antituberculosos puede variar según el espectro de fármacos, el grado, la frecuencia y la velocidad de desarrollo de la resistencia.

El grado de resistencia farmacológica de Mycobacterium tuberculosis se determina de acuerdo con criterios establecidos, que se centran en la importancia clínica de la resistencia y dependen de la actividad antituberculosa del fármaco, su farmacocinética, la concentración en la lesión, la dosis terapéutica máxima, etc.

La determinación de la susceptibilidad de las micobacterias a los fármacos se realiza actualmente mediante métodos microbiológicos:

• concentraciones absolutas (método de dilución en medios nutritivos sólidos o líquidos),
• dimensiones,
• coeficiente de resistencia.

Generalmente, la resistencia se manifiesta mediante el crecimiento visual de colonias de Mycobacteria tuberculosis. Sin embargo, existen métodos que inducen el crecimiento en las primeras etapas de la división celular micobacteriana mediante reacciones de color. Estos métodos reducen la duración de la prueba de 3-4 a 2 semanas.

El método de concentración absoluta recomendado por el Comité de Quimioterapia de la OMS se ha generalizado en Rusia como método unificado. Si bien es el más sencillo desde el punto de vista metodológico, requiere una alta estandarización y precisión en los procedimientos de laboratorio. La prueba de sensibilidad a medicamentos consiste en un juego de tubos de ensayo con un medio nutritivo modificado con fármacos antituberculosos. El juego consta de 2 o 3 tubos de ensayo con diferentes concentraciones de cada uno de los fármacos utilizados, un tubo de ensayo de control con un medio sin el fármaco y un tubo de ensayo con 1000 μg/ml de salicilato de sodio o 500 μg/ml de ácido paranitrobenzoico para detectar el crecimiento de micobacterias no tuberculosas.

Para preparar un conjunto de medios con preparaciones, utilice un medio de Lowenstein-Jensen modificado (sin almidón), que se vierte en matraces. A cada matraz se le añade un volumen de la dilución correspondiente del fármaco antituberculoso. El contenido de los matraces se mezcla bien, se vierte en tubos de ensayo y se coagula en posición inclinada durante 40 minutos a una temperatura de 85 °C. Se recomienda coagular el medio en un coagulador eléctrico con control automático de temperatura. Medio con fármacos antituberculosos.

La primera fila puede conservarse en el refrigerador a 2-4 °C durante un mes, y con los medicamentos de la segunda fila, no más de dos semanas. No se permite el almacenamiento de medios con medicamentos a temperatura ambiente. Al preparar soluciones de medicamentos antituberculosos, se tiene en cuenta su actividad, calculando la concentración con un ajuste por el peso molecular de la parte no específica del medicamento, la pureza, etc. Para determinar la sensibilidad a los medicamentos, solo se utilizan sustancias químicamente puras.

El principio del método consiste en determinar la concentración de un fármaco antituberculoso que suprime el crecimiento de una parte significativa de la población de micobacterias. Si se realiza correctamente, este método ofrece una buena fiabilidad.

Antes de realizar la prueba, es necesario asegurarse de que el cultivo aislado de Mycobacterium tuberculosis no contenga microflora extraña. Se prepara una suspensión homogénea que contiene 500 millones de cuerpos microbianos en 1 ml (estándar de turbidez óptica 5 unidades) a partir del cultivo de micobacterias en una solución de cloruro de sodio al 0,9%. La suspensión resultante se diluye con solución de cloruro de sodio al 0,9% (1:10) y se añaden 0,2 ml de la suspensión a cada tubo de ensayo del conjunto de medio nutritivo. Los tubos de ensayo inoculados se colocan en un termostato a 37 °C y se mantienen horizontalmente durante 2-3 días para que la superficie inclinada del medio nutritivo se inocule uniformemente con la suspensión de Mycobacterium tuberculosis. Luego, los tubos de ensayo se mueven a una posición vertical y se incuban durante 3-4 semanas. Los resultados se registran después de 3-4 semanas.

Dado que el aislamiento del patógeno del material clínico en medios nutritivos requiere al menos 1-1,5 meses, los resultados de la determinación de la susceptibilidad a los fármacos con este método no pueden obtenerse antes de 2-2,5 meses después de la siembra del material. Esta es una de las principales desventajas del método.

Los resultados de las pruebas de sensibilidad a fármacos de micobacterias se interpretan según ciertos criterios. En medios sólidos, un cultivo se considera sensible a la concentración del fármaco presente en el medio si el número de colonias micobacterianas cultivadas en un tubo de ensayo con el fármaco no supera las 20, con un crecimiento abundante en un tubo de ensayo control sin fármaco. Solo si hay más de 20 colonias, el cultivo se considera resistente a una concentración dada. En la práctica, cuando se obtienen resultados de crecimiento en tubos de ensayo cercanos a 20 UFC, es necesario notificar a la unidad clínica que la sensibilidad o la resistencia en este caso son limítrofes, ya que esto puede explicar en ocasiones la dinámica poco clara de los indicadores clínicos.

Para diversas preparaciones, se establece una concentración a la que se observa la reproducción de una proporción crítica de la población micobacteriana. Estas concentraciones se denominan "críticas". La magnitud del crecimiento de la población micobacteriana en un medio nutritivo con la preparación en una concentración crítica se utiliza como criterio de estabilidad.

En la práctica clínica de la tisiología, la determinación de la resistencia a los fármacos no se limita a determinar únicamente las concentraciones críticas. Esto se debe a que una definición más amplia del nivel de resistencia a los fármacos del patógeno permite al clínico formular tácticas de quimioterapia más acertadas, aprovechando el conocimiento del efecto potenciador de las combinaciones de fármacos, para anticipar la resistencia cruzada o utilizar fármacos más eficaces del grupo de fármacos antituberculosos utilizado.

El método de concentración absoluta es el más sencillo, pero también el más susceptible a errores durante su aplicación. El método de proporción es más fiable, especialmente para determinar la sensibilidad a fármacos de segunda línea, y está muy extendido fuera de Rusia. Aunque tiene en cuenta las deficiencias del método de concentración absoluta, su aplicación es más laboriosa.

El método es muy similar al de concentración absoluta. La preparación de los tubos de ensayo con los fármacos es la misma que en el método de concentración absoluta. Sin embargo, la dosis inicial de la suspensión de micobacterias de tuberculosis se reduce 10 veces, lo que elimina la frecuencia de resistencia espontánea de algunas cepas de micobacterias de tuberculosis a fármacos como etambutol, protionamida y capreomicina. Como controles, se utilizan 2 o 3 tubos con una dosis inicial igual a la de los tubos de ensayo, diluidos sucesivamente 10 y 100 veces. El criterio de resistencia es la proporción de crecimiento observado visualmente de micobacterias de tuberculosis. Para los fármacos de primera línea, el criterio de resistencia es un crecimiento excesivo del 1% de la población inicial; para los fármacos de segunda línea, un crecimiento del 1% o más del 10% de la inicial, según la concentración crítica seleccionada.

En 1997, el grupo de trabajo de la OMS y la Unión Internacional Contra la Tuberculosis sobre la detección de la resistencia a los medicamentos antituberculosos realizó ajustes a estos criterios y propuso considerar resistentes a las micobacterias que crecen en el medio denso de huevo de Lowenstein-Jensen en las siguientes concentraciones:

• dihidroestreptomicina - 4 μg/ml;
• isoniazida - 0,2 µg/ml:
• rifampicina - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

En 2001, se propusieron concentraciones críticas para los siguientes medicamentos de segunda línea (para una proporción crítica del 1%):

• capreomicina - 40 mcg/ml;
• protionamida - 40 mcg/ml;
• kanamicina - 30 μg/ml;
• viomicina - 30 μg/ml;
• cicloserina - 40 mcg/ml;
• ácido aminosalicílico - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacina - 2 mcg/ml.

Los resultados del crecimiento se evalúan después de 4 semanas como preliminares y después de 6 semanas de cultivo como finales.

Para determinar la susceptibilidad farmacológica a la pirazinamida, ampliamente utilizada en la quimioterapia moderna contra la tuberculosis, la concentración crítica recomendada es de 200 μg/ml. Sin embargo, aún no existe un método generalmente aceptado para determinar la resistencia a este fármaco en medios nutritivos sólidos, ya que su actividad antibacteriana solo se manifiesta en un ambiente ácido (pH < 6), lo cual es técnicamente difícil de mantener. Además, muchos cultivos clínicos de Mycobacterium tuberculosis son reacios a crecer en medios de huevo con un ambiente ácido.

Para evaluar la calidad de los resultados de la determinación de la farmacosensibilidad de las micobacterias, se recomienda controlar cada nuevo lote del medio de Lowenstein-Jensen mediante la determinación paralela de la farmacosensibilidad de la cepa estándar de museo H37Rv. Además, se deben cumplir ciertos criterios microbiológicos para que los métodos proporcionen un resultado reproducible y correctamente interpretado. Estos incluyen la viabilidad del cultivo de micobacterias de tuberculosis, las reglas para obtener una suspensión homogénea, las reglas para la selección de cultivos de micobacterias de tuberculosis y la representatividad de la masa bacteriana seleccionada. La fiabilidad de la determinación de la farmacorresistencia disminuye con una excreción bacteriana extremadamente baja.

Recientemente, el método para determinar la susceptibilidad a fármacos mediante sistemas automatizados se ha reconocido como prometedor. Los desarrollos más avanzados en este campo son los basados en VASTEC MGIT-960. En este caso, la susceptibilidad a fármacos de las micobacterias de tuberculosis se determina mediante un método de proporción modificado. Durante la determinación, se compara la tasa de crecimiento de las micobacterias de tuberculosis en el tubo de control y en los tubos con fármacos. Para determinar la susceptibilidad a la estreptomicina, la isoniazida, la rifampicina y el etambutol, se utilizan los aditivos enriquecedores y los antibióticos incluidos en el kit SIRE. Para determinar la susceptibilidad a la pirazinamida, se utiliza el kit PZA. Durante la prueba, los tubos de ensayo con fármacos se inoculan con una suspensión de micobacterias de tuberculosis, así como los tubos de control con una dilución de la suspensión de 100 veces para todos los fármacos, con excepción de la pirazinamida, donde la dilución de la suspensión es de 10 veces. El criterio de estabilidad es el indicador de crecimiento de micobacterias de 100 UG cuando el crecimiento en el tubo de control alcanza 400 UG (véase "Métodos de cultivo para el aislamiento de micobacterias"). Los resultados se registran e interpretan automáticamente y se configuran mediante el programa introducido o seleccionado.

Las concentraciones finales en el tubo de ensayo con medio nutritivo líquido se utilizan como concentraciones críticas. Actualmente, se han desarrollado concentraciones críticas tanto para fármacos de primera línea como para algunos de segunda línea. Cabe destacar que la determinación de la sensibilidad de las micobacterias de la tuberculosis a la cicloserina y al ácido aminosalicílico se realiza únicamente en medios nutritivos de huevo.

Un protocolo detallado para trabajar con el sistema descrito permite realizar pruebas de sensibilidad a fármacos tanto en un cultivo aislado (con un medio nutritivo denso) como utilizando el crecimiento primario de micobacterias en un tubo de ensayo MGIT. Esta última opción reduce significativamente el tiempo necesario para realizar estudios de cultivo, permitiendo obtener resultados completos del cultivo de micobacterias de tuberculosis (incluida la información sobre sensibilidad a fármacos) en un plazo de tres semanas tras la recolección del material, mientras que el método tradicional solo puede proporcionarlos al tercer mes. La obtención oportuna de resultados, cuando el paciente se encuentra en la fase intensiva del tratamiento, puede compensar el elevado coste relativo de los estudios.

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Diferenciación de micobacterias

Dado que los medios nutritivos utilizados no son estrictamente selectivos, se considera imprescindible la posterior diferenciación de las micobacterias aisladas. Esta necesidad se debe a diversas características de los procesos patológicos causados por los representantes del género: la diferente evolución y evolución de la tuberculosis y la micobacteriosis, y la presencia de resistencia natural a algunos fármacos antituberculosos.

Se reconoce que la identificación primaria de las micobacterias del complejo M. tuberculosis de las micobacterias no tuberculosas se realiza de acuerdo con las siguientes características: tasa de crecimiento en medios nutritivos densos, formación de pigmentos, morfología de las colonias, presencia de resistencia a los ácidos y temperatura óptima para el crecimiento.

Desafortunadamente, no existe un método de laboratorio único que pueda distinguir de manera confiable las micobacterias del complejo M. tuberculosis de otras micobacterias ácido-alcohol resistentes; sin embargo, una combinación de los signos descritos anteriormente con los resultados de una serie de pruebas bioquímicas que se indican a continuación permite la identificación de las micobacterias del complejo M. tuberculosis con una probabilidad de hasta el 95%.

Para diferenciar las micobacterias del complejo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii y otras) de las micobacterias no tuberculosas de crecimiento lento, se utilizan pruebas bioquímicas básicas para detectar la presencia de los siguientes signos:

• Capacidad de producir ácido nicotínico (prueba de niacina):
• actividad de la nitrato reductasa;
• catalasa termoestable;
• crecimiento en un medio con salicilato de sodio (1 mg/ml).

Como prueba adicional, también se pueden utilizar pruebas de crecimiento en un medio que contenga 500 μg/ml de ácido para-nitrobenzoico o cloruro de sodio al 5%.

Muchos laboratorios bacteriológicos identifican estos microorganismos sólo a nivel complejo, lo que se debe a las capacidades limitadas de los laboratorios y a las capacidades metodológicas de los especialistas.

En la mayoría de los casos, las siguientes pruebas son suficientes para diferenciar M. tuberculosis de M. bovis: niacina, nitrato reductasa, pirazinamidasa y registro del crecimiento en un medio con 2 μg/ml de hidrazida del ácido tiofeno-2-carboxílico. Cabe destacar que las micobacterias del complejo M. tuberculosis se caracterizan por las siguientes características:

• crecimiento lento (más de 3 semanas);
• temperatura de crecimiento entre 35-37 ^o C;
• ausencia de pigmentación (color marfil);
• coloración ácido-resistente pronunciada;
• prueba de niacina positiva;
• prueba de nitrato reductasa positiva;
• ausencia de catalasa termoestable (68 ^o C).
• Falta de crecimiento en medio Lowenstein-Jensen que contiene:
  • 1000 µg/ml de ácido salicílico sódico,
  • 500 mcg/ml de ácido para-nitrobenzoico,
  • Cloruro de sodio al 5%:
• crecimiento en presencia de 1-5 μg/ml de ácido tiofeno-2-carboxílico.

La relevancia de la diferenciación de micobacterias aisladas aumentará significativamente con el aumento de la frecuencia de registro de casos de VIH/SIDA asociados a tuberculosis o micobacteriosis. Actualmente, no existe certeza absoluta de la preparación de los laboratorios regionales para realizar correctamente este volumen de trabajo.

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Diagnóstico inmunológico de la tuberculosis

Existen diversos fenómenos, preparaciones y pruebas inmunológicas universales que se descubrieron inicialmente específicamente en la tuberculosis o en el modelo de respuesta inmunitaria a micobacterias. Estos incluyen la BCG y la tuberculina, fenómenos como la prueba de la tuberculina cutánea (pruebas de la tuberculina - reacciones de Pirquet y Mantoux) y la reacción a la administración subcutánea de tuberculina a animales sensibilizados (fenómeno de Koch). Algunos de los primeros anticuerpos contra enfermedades infecciosas también se descubrieron en la tuberculosis. Por supuesto, cuanto más se comprendan los mecanismos de la inmunidad antituberculosa y su control genético, más se podrá utilizar los métodos y preparaciones inmunológicas que afectan a la inmunidad para resolver problemas prácticos de la tisiología.

El problema práctico más importante y complejo en la actualidad se considera la detección de la tuberculosis en el proceso de cribado masivo de la población. Sin embargo, a pesar de los numerosos informes de éxito (con material limitado), no existe ningún método inmunológico (reproducible en cualquier persona) ni fármaco adecuado para estos fines.

Los métodos inmunológicos, en particular los estudios serológicos (determinación de antígenos, anticuerpos) y las pruebas de provocación a la tuberculina, se utilizan ampliamente en la práctica clínica.

Los métodos serológicos, que determinan antígenos y anticuerpos en diferentes ambientes del organismo, ocupan el primer lugar entre los estudios inmunológicos utilizados en el diagnóstico diferencial.

La especificidad de la determinación de anticuerpos contra Mycobacteria tuberculosis depende de los antígenos utilizados en el análisis inmunológico. Se han propuesto numerosos antígenos, el primero de los cuales es la tuberculina PPD.

• PPD y otras preparaciones complejas a partir de líquido de cultivo;
• desintegrante ultrasónico;
• Extracto de tritón y otras preparaciones complejas de paredes celulares;
• 5-antígeno (Daniel);
• 60-antígeno (Coccito);
• lipoarabinomanano;
• factor de cordón (trehalosa-6,6-di-micolato);
• fenólicos y otros glicolípidos;
• lipopolisacáridos;
• antígeno de unión a fibronectina;
• proteínas (la mayoría de las veces recombinantes); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA, etc.

Como resultado de muchos años de investigación por parte de científicos rusos y extranjeros, se identificaron los principales patrones de formación de anticuerpos y la efectividad del diagnóstico serológico de la tuberculosis: a mayor complejidad del antígeno, mayor sensibilidad y menor especificidad de las pruebas. La especificidad varía según el país en función del grado de infección de la población con M. tuberculosis y micobacterias no tuberculosas, la vacunación con BCG, etc. En niños, el valor informativo del serodiagnóstico es menor que en adultos. En la tuberculosis primaria (más frecuente en niños), la determinación de IgM es más informativa; en la tuberculosis secundaria, la de IgG. En personas con infección por VIH, el valor informativo del serodiagnóstico para la determinación de anticuerpos es menor. La efectividad de la determinación de anticuerpos depende de varios factores clínicos: la actividad del proceso (la presencia o ausencia de aislamiento de micobacterias, la presencia de cavidades de descomposición, el grado de infiltración), la prevalencia del proceso y su duración.

La sensibilidad del método de enzimoinmunoensayo (EIA) es de aproximadamente el 70 %. La insuficiente eficacia del estudio se debe a su baja especificidad. Anteriormente, se consideró la posibilidad de utilizar el cribado serológico en grupos de alto riesgo, en particular en personas con alteraciones pulmonares posttuberculosas.

Para aumentar la especificidad de la prueba ELISA, se buscan antígenos más específicos, incluyendo aquellos obtenidos por ingeniería genética: ESAT-6, etc. (ver arriba). El uso de antígenos estrictamente específicos (38 kDa, ESAT) aumenta la especificidad, pero reduce significativamente la sensibilidad del análisis. Junto con la prueba ELISA (sistemas de prueba de laboratorio experimentales, como el kit Pathozyme ELISA), también se ofrecen kits inmunocromatográficos con filtración lateral (Mycodot), así como otras pruebas similares (análisis de puntos de membrana) con evaluación visual del resultado de la prueba. Al realizar estas pruebas, el análisis toma de 10 a 30 minutos; no requieren equipo especial, requieren una evaluación visual de los resultados, lo cual está asociado con cierta subjetividad. Estos métodos tienen aproximadamente las mismas características de sensibilidad y especificidad (70% y 90-93%, respectivamente) que la prueba ELISA tradicional.

El uso de métodos de inmunoanálisis resulta valioso como método adicional en el diagnóstico diferencial de la tuberculosis, especialmente en sus formas extrapulmonares. El método ELISA es especialmente eficaz en el diagnóstico de la meningitis tuberculosa al examinar el líquido cefalorraquídeo. En este caso, la sensibilidad del análisis es del 80-85% y la especificidad, del 97-98%. Existe información sobre la eficacia de la determinación de anticuerpos contra Mycobacterium tuberculosis en el líquido lagrimal para el diagnóstico de la uveítis tuberculosa.

Inducción de la síntesis de interferón gamma in vitro

El interferón gamma (IFN-γ) es un factor de protección inmunitaria específica que se logra mediante la activación de los sistemas enzimáticos de los macrófagos. La inducción de la síntesis de IFN-γ por los linfocitos T sensibilizados se debe a su interacción con antígenos micobacterianos.

Tanto la tuberculina PPD como los antígenos específicos obtenidos por ingeniería genética se utilizan como antígenos, en particular el antígeno ESAT-6 (antígeno de secreción temprana con un peso molecular de 6 kDa) y CFP-10 (proteína de filtrado de cultivo, 10 kDa). Los antígenos modificados genéticamente o recombinantes están ausentes en las células de la vacuna BCG y otras micobacterias. Cuando se utiliza la tuberculina, los resultados de la prueba de inducción de IFN-γ son comparables a los resultados de la prueba cutánea de la tuberculina (correlación directa). Cuando se utilizan antígenos modificados genéticamente, los resultados de la prueba son más específicos y no dependen de la vacunación previa con BCG. Al examinar a individuos vacunados que no han tenido contacto con la infección tuberculosa, la especificidad de la prueba es del 99%. La sensibilidad de la prueba entre los pacientes con tuberculosis varía del 81 al 89%.

Se han desarrollado pruebas y diagnósticos basados en el cultivo a corto plazo de células sanguíneas completas o células mononucleares aisladas de sangre con antígenos de micobacterias de tuberculosis in vitro, seguido de la determinación de la concentración de IFN-γ o el recuento del número de linfocitos T que sintetizan IFN-γ. La concentración de interferón sintetizado en un tubo de ensayo se determina mediante ELISA utilizando anticuerpos monoclonales que se unen a IFN-γ. Posteriormente, mediante la calibración de IFN-γ estándar, se determina su concentración en el tubo de ensayo o en los pocillos de la placa.

En la prueba Elispot, se cuenta el número de células T que sintetizan IFN-γ en la superficie de una placa recubierta con anticuerpos contra IFN-γ.

Los desarrolladores del diagnóstico de inducción de IFN-γ in vitro, aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA), afirman que la prueba no puede diferenciar la infección tuberculosa latente de la tuberculosis activa. Por lo tanto, en regiones con una alta tasa de infección, la prueba no tiene valor diagnóstico directo. Sin embargo, en nuestro país, puede utilizarse para diferenciar la infección tuberculosa en niños de la alergia posvacunal, así como para evaluar el nivel de inmunidad específica durante el tratamiento.

Actualmente, se está estudiando un sistema de prueba doméstico para determinar la inducción de la síntesis de IFN-γ por antígenos específicos de tuberculosis in vitro.

Estado inmunológico y evolución de la tuberculosis, inmunocorrección

Durante el tratamiento de la tuberculosis se producen en las personas cambios en la antigenemia y en el estado del sistema inmunológico.

Los datos sobre los cambios en los exudados y tejidos son en gran medida contradictorios. Lo único que puede señalarse con plena justificación es que los granulomas tuberculosos, por regla general, contienen una cantidad significativa de linfocitos T activados.

Tiene sentido detenerse en dos puntos más que son necesarios para comprender el papel de los mecanismos inmunológicos en el tratamiento de la tuberculosis en humanos:

• Los pacientes con SIDA tienen una incidencia particularmente alta de desarrollar resistencia a múltiples fármacos;
• En caso de resistencia a múltiples fármacos (y en ausencia de infección por VIH), los trastornos inmunológicos (principalmente la inmunidad de las células T) son particularmente significativos.

En caso de tuberculosis se utilizan ampliamente diversos métodos de inmunocorrección: en primer lugar, se trata de medicamentos que actúan principalmente sobre la inmunidad de las células T y el sistema fagocítico mononuclear (hormonas del timo, isófona, licopida, polioxidonio, etc.), así como micobacterias completas (atenuadas) y sus componentes.

Diagnóstico biológico molecular de la tuberculosis

Los métodos de biología molecular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas incluyen principalmente métodos basados en la manipulación de material genómico de patógenos bacterianos y virales para identificar material genético específico (secciones de ADN con una secuencia de nucleótidos específica de una especie o cepa de patógeno), analizar secuencias de ADN específicas en genes que determinan la sensibilidad del patógeno a ciertos fármacos y analizar la actividad funcional de ciertos genes del patógeno. Los métodos de biología molecular se han generalizado en la investigación científica y se han aplicado en la práctica para el diagnóstico y la monitorización de diversas infecciones bacterianas y virales tras el descubrimiento de la reacción en cadena de la polimerasa en 1985 por Carrie Mullis (Premio Nobel en 1989).

Principios y capacidades del método de reacción en cadena de la polimerasa

La PCR permite la amplificación (multiplicación) de una secuencia de nucleótidos (un fragmento de ADN patógeno) en un tubo de ensayo en pocas horas, multiplicándola por millones. La realización de la reacción en presencia de cadenas individuales de ADN determina la excepcionalmente alta sensibilidad del análisis.

La secuencia de nucleótidos de ciertas secciones de la cadena de ADN determina la singularidad genética del microorganismo, lo que explica la alta especificidad de la PCR.

La importancia de este método para la detección y estudio de las características de Mycobacterium tuberculosis se debe a las características biológicas del microorganismo, que tiene un crecimiento muy lento: el tiempo de duplicación del ADN de Mycobacterium tuberculosis durante su cultivo es de 12-24 horas.

El principio del método PCR es la amplificación: multiplicación múltiple, millones de veces, de secciones de una secuencia específica de ADN en un microvolumen de tubo de ensayo con repetición cíclica de las siguientes tres etapas de reacción, cada una de las cuales tiene lugar en un régimen de temperatura diferente:

• Etapa I - desnaturalización del ADN bicatenario por calentamiento con divergencia de sus cadenas;
• Etapa II: unión complementaria (hibridación) de cebadores (oligonucleótidos de cebado) con las secciones finales de las cadenas de un fragmento de ADN estrictamente específico seleccionado para la amplificación;
• Etapa III: finalización de la cadena de fragmentos de ADN utilizando la ADN polimerasa termoestable.

Para la amplificación, el tubo de ensayo debe contener moléculas de ADN matriz. Cuatro tipos de desoxinucleósidos trifosfato (nucleótidos) con sus correspondientes bases nitrogenadas: adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C); oligonucleótidos de cebado (cebadores) sintetizados artificialmente, compuestos de 18 a 20 pares de bases; una enzima termoestable, la ADN polimerasa, con una temperatura óptima de 68 a 72 ^° C, e iones de magnesio.

La especificidad de la PCR depende de la elección del fragmento de ADN. En función de ello, se sintetizan los oligonucleótidos cebadores flanqueantes. La especificidad de la hibridación y la compleción de la cadena de ADN se determina por el principio de complementariedad de los siguientes pares de bases nitrogenadas: adenina-timina, guanina-citosina.

Para determinar el genoma de las micobacterias del complejo de tuberculosis, la diana de amplificación más eficaz en la mayoría de los sistemas de prueba es el fragmento de ADN IS6110, que en la mayoría de las cepas de micobacterias de tuberculosis presenta un número significativo (10-20) de repeticiones en el genoma, lo que garantiza, además de especificidad, una alta sensibilidad del análisis. Asimismo, se han descrito cepas de micobacterias de tuberculosis con un número reducido de repeticiones o la ausencia del fragmento IS6110.

Extracción de moléculas de ADN de una muestra biológica

Para realizar la PCR es necesario aislar las moléculas de ADN del patógeno del material biológico en un volumen mínimo, con una cantidad mínima de ADN no específico y diversos inhibidores de la enzima ADN polimerasa.

La preparación de las muestras debe realizarse en condiciones que eviten la contaminación cruzada de las muestras en estudio con moléculas de ADN aisladas. Esto requiere un tratamiento previo de la sala con luz ultravioleta, así como de los suelos y las superficies de trabajo de las mesas y dispositivos, con soluciones cloradas. También es necesario utilizar guantes limpios, tubos de ensayo desechables y puntas para pipetas automáticas.

Para aislar el ADN de Mycobacterium tuberculosis de muestras clínicas (líquido cefalorraquídeo, lavado bronquial) que no contienen gran cantidad de leucocitos, restos celulares o sales, basta con centrifugar la muestra a 3-4 mil revoluciones por minuto, añadir 20-30 µl de una solución al 2% de Triton X-100 al sedimento y calentar a 90 ^o C durante 30 minutos.

La preparación de muestras de esputo requiere una licuefacción eficiente, que suele utilizar hidróxido de sodio al 4 % y N-acetil-L-cisteína (NALC) a una concentración de 50-80 mg por muestra, según su viscosidad. La solución de NALC debe prepararse ex tempore, o bien, el polvo de NALC puede añadirse directamente a la muestra en seco. Tras la licuefacción, las muestras deben centrifugarse durante 15 minutos a 3500-4000 rpm (3000 g) en tubos de 50 ml con tapón de rosca, es decir, en las mismas condiciones recomendadas para la preparación de esputo precultivo.

Para extraer ADN del sedimento, se suele emplear un método basado en el uso de una solución 5-6 molar de isotiocianato de guanidina como reactivo de lisis y partículas microporosas de óxido de silicio ("tierra de diatomeas") que absorben las moléculas de ADN. Las sustancias no específicas, incluidos los posibles inhibidores, se lavan posteriormente en una solución 2,5 molar de isotiocianato de guanidina y una solución de etanol. Tras ello, las moléculas de ADN se desorben en agua y estas muestras se utilizan para realizar la PCR. Para simplificar la tecnología de extracción de ADN, la tierra de diatomeas suele sustituirse por micropartículas magnéticas recubiertas de óxido de silicio. En este caso, se utiliza un soporte magnético especial para microtubos para precipitar las partículas en lugar de centrifugarlas.

En Rusia se ha desarrollado un método original de separación inmunomagnética de micobacterias con posterior extracción del ADN del patógeno. Para la separación inmunomagnética de micobacterias de tuberculosis, se utilizan ferropartículas de 3-5 μm de tamaño, recubiertas de óxido de silicio, a las que se unen mediante un enlace químico anticuerpos policlonales (de conejo) contra micobacterias de tuberculosis. Tras la lisis alcalina, las muestras de esputo se neutralizan con una solución ácida de Tris-HCl y se incuban con un sorbente inmunomagnético. A continuación, las inmunoferropartículas se recogen con una varilla magnética con punta reemplazable, se transfieren a un microtubo y se precipitan. Se añaden 20-30 μl de una solución de Triton X-100 al 2 % y se calientan durante 30 minutos a 90 ^° C. El sobrenadante se utiliza como matriz de ADN para el análisis por PCR.

La extracción de ADN de micobacterias de tuberculosis a partir de biopsias es un problema complejo. Para la lisis de la biopsia, se utiliza la enzima proteinasa K a una concentración final de 200-500 mg/l a una temperatura de 56 ^° C durante la noche. Posteriormente, se extrae mediante uno de los métodos conocidos. El exceso de ADN inespecífico en el análisis por PCR de biopsias suele inhibir la reacción, lo que requiere repetidas extracciones de ADN.

Métodos de detección de resultados

Una vez completada la reacción, los fragmentos amplificados de ADN del patógeno se identifican utilizando varios métodos.

El método de electroforesis en gel es bien conocido. En este caso, el fragmento de ADN obtenido se identifica mediante un control positivo que contiene el fragmento de ADN específico deseado, o mediante un tamaño previamente conocido (número de pares de nucleótidos) del fragmento, determinado mediante un marcador molecular estándar.

En presencia de un colorante específico, el bromuro de etidio, que está incluido en el ADN de doble cadena, el fragmento de ADN sintetizado se revela como una banda que brilla bajo la influencia de la luz ultravioleta.

El tamaño del fragmento de ADN, determinado por electroforesis en función de la distancia recorrida desde el inicio, debe corresponder a un marcador de peso molecular conocido o a un control positivo.

Otros métodos para determinar los resultados de la PCR se basan en la hibridación de productos de PCR de cadena sencilla con un oligonucleótido complementario (una sonda de ADN marcada con biotina), seguida de una detección mediante una reacción enzimática, por ejemplo, uniendo un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina a la biotina.

Basándose en este tipo de detección, se han creado analizadores PCR en los que la detección de los resultados de la PCR se realiza de forma automática como resultado de la lectura de la densidad óptica en las muestras una vez producida la reacción enzimática.

Las desventajas de estos métodos incluyen la posibilidad de contaminación intralaboratorio con fragmentos relativamente cortos de moléculas de ADN. Cuando estas moléculas entran en las muestras recién analizadas, se convierten en una matriz para la PCR y dan lugar a resultados falsos positivos.

En este sentido, para evitar resultados falsos positivos, se introducen normas estrictas para la separación y aislamiento de salas: para la extracción de ADN de muestras biológicas; salas para la detección de resultados (electroforesis) de la zona limpia. Estas salas representan una zona de probable contaminación. Otra zona aislada es una sala limpia para introducir las muestras de ADN en estudio en tubos de ensayo con la mezcla de reacción para PCR. Finalmente, se asume que el dispositivo principal (el amplificador de ADN) debe trasladarse a una sala separada, posiblemente una oficina.

Para evitar la contaminación por amplicones (productos de reacciones previas), algunos sistemas de PCR contienen uridina desoxinucleósido en lugar de timidina desoxinucleósido, que se construye en la posición correspondiente durante la síntesis de cadena in vitro. Es decir, la timina, una base nitrogenada presente en el ADN nativo, se reemplaza por uracilo. La uracilo ADN glicosilasa añadida a la mezcla de reacción del material analizado destruye únicamente los fragmentos contaminantes con desoxiuridina, pero no el ADN nativo analizado que contiene desoxitimidina. El calentamiento posterior a 94 ^° C inactiva esta enzima y no interfiere con la amplificación en PCR.

Existe un sistema de prueba basado en la amplificación isotérmica del ARNr, para el cual primero se realiza la transcripción inversa y la síntesis de moléculas de ADN, que a su vez constituyen la matriz para la posterior síntesis de moléculas de ARN. Los amplicones de ARN se detectan mediante una sonda de ADN teñida con acridina durante la hibridación en una solución de tubo de reacción. Este método, además de su alta sensibilidad, tiene la ventaja de realizar el análisis en un solo tubo, lo que evita la contaminación. Según los autores, la sensibilidad de este método en muestras respiratorias alcanza el 90 % con una especificidad del 99-100 %.

Se han implementado nuevos métodos de detección en la PCR en tiempo real. Estos métodos se diferencian principalmente en que la PCR y la detección de sus resultados se realizan simultáneamente en un tubo de ensayo cerrado. Esto no solo simplifica tecnológicamente el método de análisis, sino que también evita la contaminación de las instalaciones y muestras del laboratorio por productos de PCR anteriores.

En la PCR en tiempo real, los resultados se detectan mediante la fluorescencia resultante de la hibridación de una sonda de ADN fluorogénica con un fragmento específico de ADN amplificado durante la PCR. La estructura de las sondas de ADN fluorogénicas está diseñada de tal manera que el marcador fluorescente se libera como resultado de una reacción enzimática o se distancia de la molécula extintora de fluorescencia solo tras la hibridación específica con la molécula de ADN deseada amplificada durante la PCR. A medida que aumenta el número de moléculas hibridadas con la sonda, el aumento de la fluorescencia hasta un nivel detectable es proporcional al número de moléculas del producto amplificado. Dado que el número de moléculas de fragmentos de ADN se duplica durante cada ciclo de PCR, el número de ciclos a partir del cual se detecta y aumenta la fluorescencia es inversamente proporcional al número de moléculas de ADN en la muestra original. Si se introducen en la reacción varias concentraciones conocidas de moléculas del fragmento correspondiente de ADN de la micobacteria de la tuberculosis como calibrador, se puede calcular el número de genomas de ADN en el material en estudio mediante un programa informático.

Cada muestra estándar se duplica. El criterio cuantitativo es el número mínimo de ciclos de PCR necesarios para el inicio y el crecimiento de la fluorescencia detectable. El eje de abscisas es el número de ciclos; el eje de ordenadas es el valor de fluorescencia. Las concentraciones de ADN son inversamente proporcionales al número de ciclos necesarios para que aparezca la fluorescencia. Las ventanas en la columna derecha (21-32) muestran los números de ciclo para las concentraciones correspondientes. Las diferencias entre concentraciones de 10 veces de fragmentos de ADN 10 ² -10 ⁶ ml son 3,2-3,4 ciclos. Para dos pacientes, las concentraciones de fragmentos IS6110 fueron aproximadamente 10 ³ /ml y 10 ⁴ /ml. Teniendo en cuenta el número de repeticiones (6-20) de los fragmentos analizados en el genoma de Mycobacterium tuberculosis, el número de Mycobacterium tuberculosis en las muestras clínicas es de aproximadamente 100 y 1000 células, respectivamente.

Aplicación de la PCR en el diagnóstico de la tuberculosis

El método PCR se utiliza con mayor frecuencia para el diagnóstico rápido de tuberculosis: la detección de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas: esputo, lavados bronquiales, exudado pleural, orina, líquido cefalorraquídeo, punciones de osteólisis, aspirados del tracto genital femenino y diversas biopsias. En un estudio realizado en Holanda con aproximadamente 500 muestras de esputo y lavados bronquiales de 340 pacientes con diagnóstico confirmado de tuberculosis pulmonar, se estudió la sensibilidad comparativa de los métodos PCR, cultivo y baciloscopia. La sensibilidad del análisis fue del 92,6 %, 88,9 % y 52,4 %, respectivamente. La especificidad de todos los métodos fue de aproximadamente el 99 %.

Se comparó la eficiencia de detección de Mycobacterium tuberculosis mediante baciloscopia, siembra en medio de Lowenstein-Jensen, el sistema de prueba VASTES y análisis por PCR. La PCR mostró una sensibilidad del 74,4 %, la microscopía del 33,8 %, la siembra en un medio sólido del 48,9 % y VASTES del 55,8 %. El tiempo promedio de detección para la siembra en medio de Lowenstein-Jensen es de 24 días. VASTES: 13 días, PCR: 1 día.

También se analiza el potencial de utilizar la PCR como un método sensible y rápido para monitorear la efectividad del tratamiento de la tuberculosis.

La detección del ADN de Mycobacterium tuberculosis mediante el método PCR con quimioterapia eficaz se determina durante un período de tiempo más largo: en promedio, 1,7 meses en comparación con la excreción bacteriana determinada por microscopía de fluorescencia y 2,5 meses en comparación con el examen bacteriológico.

Diagnóstico de las formas extrapulmonares de tuberculosis

La importancia de la PCR como método sensible es especialmente grande para las formas extrapulmonares, ya que es precisamente en estas formas que los métodos clínicos y radiológicos y los métodos bacteriológicos tradicionales para la determinación de Mycobacterium tuberculosis en materiales de diagnóstico son ineficaces.

Al examinar muestras de orina, los resultados del análisis de PCR fueron positivos en 16 de 17 pacientes con tuberculosis activa del sistema urinario y negativos en 4 pacientes con tuberculosis renal inactiva y 39 pacientes con enfermedades no tuberculosas del sistema urinario.

Se demostró la eficiencia del análisis de PCR en el estudio de aspirados de médula ósea en pacientes con fiebre de génesis desconocida con sospecha de naturaleza tuberculosa de la enfermedad. Para el diagnóstico de linfadenitis tuberculosa en niños, se estudiaron 102 aspirados por punción y muestras de biopsia de 67 niños con sospecha de linfadenitis tuberculosa. Se obtuvieron resultados positivos: por PCR en tiempo real - 71,6%, microscopía de fluorescencia - 46,3%, estudio de cultivo - 41,8%. En el estudio de 50 biopsias de ganglios linfáticos en pacientes con enfermedad por arañazo de gato, todos los resultados fueron negativos. Por lo tanto, se demostró una especificidad del 100% del análisis de PCR. En el mismo trabajo, se demostró la posibilidad de detectar M. avium en la biopsia por punción de los ganglios linfáticos.

El diagnóstico de tuberculosis genital femenina en la infertilidad es conocido por ser uno de los problemas diagnósticos más difíciles. Se obtuvieron resultados positivos en estudios de PCR de biopsias endometriales, aspirados endometriales y muestras de líquido de la bolsa de Douglas en 14 (56%) de 25 pacientes examinadas por laparoscopia con sospecha de tuberculosis. Los estudios de baciloscopia y cultivo arrojaron 1 y 2 resultados positivos, respectivamente. Estos casos también fueron positivos por PCR. La mayoría de los resultados positivos por PCR se dieron en casos con características de tuberculosis según el examen histológico; un número menor se dio en casos con sospecha de tuberculosis según laparoscopia. Solo se obtuvo un resultado positivo por PCR en ausencia de datos laparoscópicos para tuberculosis.

Al diagnosticar formas extrapulmonares de tuberculosis, los médicos suelen preguntarse si es posible identificar el patógeno al examinar muestras de sangre mediante PCR. La literatura médica indica que la detección de ADN de Mycobacterium tuberculosis en muestras de sangre es posible en formas avanzadas de infección por VIH. El ADN de Mycobacterium tuberculosis solo se detectó en casos de tuberculosis generalizada de diversos órganos en pacientes con trasplante renal e inmunosupresión.

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Identificación de especies de micobacterias

El método PCR puede ser muy eficaz para la identificación rápida de micobacterias del complejo tuberculoso y algunos tipos de micobacterias no tuberculosas tras obtener su crecimiento primario. En este caso, el uso de PCR puede ahorrar de 7 a 10 días para la posterior identificación de un resultado positivo mediante cultivo. El estudio PCR es técnicamente muy sencillo, ya que no requiere una preparación compleja de muestras de material clínico para lograr una alta sensibilidad. Al examinar 80 cultivos positivos en un sistema de prueba de este tipo (MB BacT. de Organon), todos los resultados positivos del análisis PCR fueron estrictamente específicos y se realizaron en un día. Para identificar otros tipos de micobacterias cuando se obtienen en cultivo, el ADN del patógeno se hibrida con sondas de ADN específicas marcadas con acridina, y las cepas se detectan mediante la aparición de quimioluminiscencia utilizando un quimioluminómetro o en tiras de nitrocelulosa con evaluación visual después de la hibridación. Este kit identifica un número limitado de especies: complejo Mycobacterium tuberculosis, M. avium, complejo M. avium, M. kansasii y M. gordonae.

A. Telenti et al. también desarrollaron un método relativamente simple y económico para la identificación de especies de micobacterias clínicamente importantes, basado en PCR y posterior tratamiento con dos enzimas de restricción (enzimas que tienen la capacidad de cortar una molécula de ADN en puntos específicos). En este caso, se amplifica un fragmento de ADN que codifica una proteína de choque térmico (65 kDa), tras lo cual el fragmento de ADN obtenido en PCR, de 439 pares de nucleótidos de tamaño, se trata por separado con dos enzimas: Bste II y Nae III. Posteriormente, mediante electroforesis en gel de agarosa, se analizan los dos productos obtenidos, determinando sus tamaños (número de pares de nucleótidos) utilizando un conjunto de fragmentos de ADN estándar (marcadores moleculares de ADN) de 100 a 1000 pares de nucleótidos de longitud. En cada una de las especies definidas (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum) se encuentran 2 o 3 fragmentos de ADN de diferentes tamaños para cada enzima de restricción. La combinación de los fragmentos de ADN resultantes, de diferentes tamaños, permite diferenciar estas especies entre sí.

Se está desarrollando una tecnología de microarrays de ADN biológico que ayudará a identificar más de 100 especies de micobacterias en un solo estudio.

La identificación de especies también puede realizarse mediante la amplificación por PCR de la región variable del ARNr 16S seguida de la secuenciación de los amplicones en comparación con la estructura primaria correspondiente, lo que permite la identificación de más de 40 especies de micobacterias.

La PCR también permite identificar especies dentro del complejo micobacteriano de la tuberculosis, incluyendo la diferenciación entre M. bovis y M. bovis BCG. Esto se realiza analizando la presencia o ausencia de ciertos genes en las regiones genómicas RD1, RD9 y RD10. RD1 está ausente en M. bovis BCG, pero está presente en especies virulentas, como M. bovis.

Determinación de la susceptibilidad a fármacos de Mycobacterium tuberculosis mediante PCR

Las tareas de los métodos genéticos moleculares para determinar la sensibilidad o resistencia a fármacos de Mycobacterium tuberculosis se reducen a la identificación de mutaciones en ciertas secuencias de nucleótidos de genes conocidos. Los métodos principales se basan en la lectura directa (secuenciación) de estas secuencias tras la amplificación o en la hibridación de fragmentos de ADN marcados con biotina, amplificados mediante PCR, con sondas de ADN. Ambas opciones implican la identificación de sustituciones en secuencias de nucleótidos que, al utilizar sondas de ADN, provocan la ausencia o incompleta hibridación en una membrana de nitrocelulosa mediante un conjugado enzimático (estreptavidina-fosfatasa alcalina): el método LIPA-Rif-TB.

El método para medir la fluorescencia en sondas de ADN fijadas localmente en microrregiones complementarias a mutaciones conocidas en regiones génicas amplificadas por PCR responsables de la sensibilidad o resistencia a fármacos se denomina método de microbiochips. El algoritmo básico para realizar este estudio es el siguiente. Después de aislar el ADN de una muestra clínica o de un cultivo micobacteriano, se debe realizar una PCR para amplificar los fragmentos correspondientes del gen groB responsable de la sensibilidad a la rifampicina, o los genes katG e inhA que codifican proteínas micobacterianas responsables de la sensibilidad a la isoniazida. Los resultados de la PCR se evalúan mediante electroforesis en gel de agarosa, que confirma la recepción de los fragmentos de ADN correspondientes de la longitud deseada. A continuación, se realiza una segunda ronda de PCR para introducir un marcador fluorescente en el ADN. Los resultados de la PCR se confirman de nuevo mediante electroforesis en gel. Posteriormente, se lleva a cabo la hibridación (incubación durante la noche) y el material obtenido se lava en un biochip, que consiste en un gran número de cadenas cortas de ADN (sondas) fijadas en una pequeña placa de vidrio. Estas cadenas complementan las secuencias de nucleótidos de la micobacteria tuberculosa sensible a fármacos en los puntos de posibles mutaciones, así como las secuencias mutantes responsables de la resistencia a fármacos. La ubicación de las sondas de ADN en la placa está estrictamente definida y se establece el nivel de fluorescencia observado durante la hibridación para determinar el resultado mediante un dispositivo de lectura especial. Para ello, los resultados del análisis se determinan mediante un programa informático específico.

En los últimos años se han desarrollado métodos alternativos para determinar la sensibilidad a fármacos de Mycobacterium tuberculosis basados en la tecnología de PCR en tiempo real, lo que permite realizar estos estudios en modo de tubo de ensayo cerrado.

La Figura 13-13 muestra el resultado del análisis de cultivos clínicos de Mycobacterium tuberculosis para determinar la resistencia a rifampicina mediante PCR en tiempo real: 218: muestra control (sensible a rifampicina); 93: control positivo para la mutación Ser-Trp TCG-TGG; 4482: control positivo para la mutación Ser-Leu TCG-TTG; 162-322: muestras experimentales. Resultado del cálculo de las curvas cinéticas de amplificación para 4 canales: canal 1: 393: control positivo para la mutación Ser-Trp TCG-TGG; canal 2: 4482: control positivo para la mutación Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295: muestras experimentales; canal 4: curvas cinéticas de amplificación de todas las muestras del experimento. Control positivo de la reacción de amplificación. Conclusiones: El análisis reveló las siguientes mutaciones que determinan la resistencia a la rifampicina: en las muestras 162, 163, 172 y 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Se utilizó el mismo principio para determinar la resistencia a la isoniazida mediante los genes katG e inhA, que determinan las mutaciones más frecuentes.

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Identificación de la cepa de Mycobacterium tuberculosis

El método más estudiado para la identificación de cepas de Mycobacterium tuberculosis es una tecnología denominada polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), que se basa en la fragmentación (restricción) del ADN de Mycobacterium tuberculosis mediante la enzima Pvu II y la posterior hibridación de los fragmentos obtenidos con secuencias específicas del ADN de su elemento repetitivo IS6110. La variabilidad intraespecífica se debe al diferente número de repeticiones de IS6110 y su ubicación en el ADN, así como a la diversidad de distancias entre ciertos puntos de ataque de la enzima de restricción (sitios de restricción) y el elemento IS6110. Esta tecnología es muy compleja y laboriosa. Tras tratar el ADN aislado del cultivo de Mycobacterium tuberculosis con la enzima de restricción, se realiza una electroforesis en gel. A continuación, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se transfieren a una membrana de nitrocelulosa, se hibridan con fragmentos del elemento IS6110 y los resultados se detectan mediante una reacción enzimática. El patrón de bandas específico resultante caracteriza el ADN de una cepa específica de Mycobacterium tuberculosis. El análisis computacional revela la identidad o parentesco de las cepas. Si bien el método RFLP es el más discriminante, es decir, revela el mayor número de diferencias en las cepas analizadas, resulta ineficaz con un pequeño número (menos de 5) de repeticiones de IS6110, observadas en algunas cepas. Las figuras 13-14 muestran los resultados de la tipificación RFLP de las cepas.

Una alternativa podría ser el método de spoligotyping (análisis del polimorfismo de las secuencias espaciadoras de ADN intermedias entre las repeticiones directas de la región DR). Para el spoligotyping de cepas, se realiza una PCR con cebadores que limitan la región DR, tras lo cual se forman fragmentos de diferentes longitudes que hibridan con regiones intermedias variables de ADN. El análisis de las secuencias espaciadoras de la región DR parece, según los investigadores, más sencillo, productivo y adecuado para el cribado primario de cepas y el análisis epidemiológico preliminar, así como para el estudio directo de material clínico.

Obviamente, un método más eficaz y tecnológicamente accesible es el VNTR (abreviatura de palabras inglesas), o el método para determinar el número variable de repeticiones en tándem exactas en el ADN de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa únicamente en el uso de PCR y no requiere manipulaciones adicionales. Dado que el número de repeticiones en tándem varía en diferentes cepas y loci, se determinan y analizan fragmentos de distintos tamaños en el electroforegrama resultante de los productos de PCR. Según los investigadores, con la ayuda del VNTR, se logra un mayor grado de discriminación de cepas que con el método RFLP.

En los últimos años se ha prestado mucha atención a la propagación de cepas de Mycobacterium tuberculosis de la familia W-Beijing (a veces llamada cepa Beijing), que son en gran medida resistentes a los medicamentos.

Requisitos básicos para la calidad de la investigación biológica molecular

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Principales documentos regulatorios para la realización de PCR

Órdenes del Ministerio de Salud de la Federación Rusa: n.º 45 del 7 de febrero de 2000; n.º 109 del 21 de marzo de 2003; n.º 64 del 21 de febrero de 2000. Directrices: 1.3.1888-04 "Organización del trabajo durante la investigación por PCR de material infectado con agentes biológicos patógenos de los grupos de patogenicidad III-IV"; 1.3.1794-03 "Organización del trabajo durante la investigación por PCR de material infectado con microorganismos de los grupos de patogenicidad I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Desinfección de material de prueba infectado con bacterias de los grupos de patogenicidad I-IV durante el trabajo con el método PCR", 2001. Apéndice 11 de las Instrucciones sobre métodos unificados de investigación microbiológica para la detección, el diagnóstico y el tratamiento de la tuberculosis.

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Personal

Los estudios de biología molecular podrán ser realizados por médicos de diagnóstico clínico de laboratorio, bacteriólogos, virólogos, biólogos de diagnóstico clínico de laboratorio, así como por especialistas con formación médica secundaria que hayan realizado una especialización y formación avanzada en la forma establecida.

Disposición de las instalaciones del laboratorio

Se requieren las siguientes instalaciones de laboratorio:

• Área de procesamiento de muestras: laboratorio adaptado para trabajar con agentes infecciosos de los grupos de patogenicidad III-IV, de acuerdo con las Directrices Metodológicas 13.1888-04.
• El área para preparar mezclas de reacción de PCR es una sala de laboratorio que brinda protección contra la contaminación interna del laboratorio: un área “limpia”.
• Si se utiliza electroforesis o hibridación para analizar productos de PCR, la sala del laboratorio donde se extraen los fragmentos de ADN amplificados del tubo de amplificación y, por consiguiente, pueden entrar en contacto con el ambiente, de acuerdo con los requisitos para laboratorios de PCR (Directrices Metodológicas 1.3.1794-03, Directrices Metodológicas 1.3.1888-04), debe estar completamente aislada de las salas especificadas en los párrafos anteriores. Se debe evitar el movimiento de personal, equipo, materiales y objetos desde el área de electroforesis hasta el área de procesamiento de muestras y el área limpia, así como la transferencia de aire a través del sistema de ventilación o por corrientes de aire. Esta área no es necesaria para la detección fluorimétrica de productos de PCR.
• La sala de documentación y procesamiento de resultados está equipada con ordenadores y el equipo de oficina necesario. Esta sala puede contener equipos que garanticen la detección de productos de PCR sin necesidad de abrir el tubo: detectores de PCR fluorescentes y termocicladores para PCR en tiempo real.

Los requisitos sanitarios y epidemiológicos para el procesamiento primario del esputo son similares a los requisitos microbiológicos estándar para trabajar con Mycobacterium tuberculosis.

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Conjunto completo de equipos de laboratorio para diagnóstico por PCR

El kit de laboratorio incluye equipamiento para las siguientes salas.

• Sala de preparación de muestras, que contiene el siguiente equipamiento: campana de flujo laminar de clase de protección II "SP-1.2": termostato de estado sólido con tapa calefactada para tubos de ensayo Eppendorf; microcentrífuga a 13.000 rpm; centrífuga ("Vortex"); refrigerador con un rango de temperatura de -20 ^° C a +10 ^° C; pipetas de volumen variable de la serie "Proline"; bomba con matraz trampa OM-1; gradilla para pipetas; gradilla para estación de trabajo de 200 x 0,5 ml; gradilla para estación de trabajo de 50 x 1,5 ml; gradillas para almacenar tubos de ensayo de 80 x 1,5 ml;
• sala de preparación de la mezcla de reacción: cámara protectora caja PCR ("Laminar-C. 110 cm); centrífuga "Vortex"; pipetas de volumen variable de la serie "Proline"; gradilla para pipetas; gradilla para estación de trabajo 200x0,2 ml; gradillas para almacenar tubos de ensayo 80x1,5 ml; refrigerador con un rango de temperatura de -20 ^° C a +10 ^° C;
• Sala de electroforesis: cámara de electroforesis horizontal; fuente de energía; transiluminador;
• Amplificador de ADN o analizador de ácidos nucleicos (PCR en tiempo real) con computadora y software; se puede instalar en cualquier sala disponible. Si se utiliza tecnología de PCR en tiempo real, no se necesita una sala de electroforesis.

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Control de calidad externo

Para garantizar la obtención de resultados objetivamente fiables, los laboratorios deben participar en un sistema de evaluación externa de la calidad de la investigación de laboratorio.

Los participantes en el sistema de control de calidad reciben: 12 ampollas con suspensiones liofilizadas de células bacterianas, dos de las cuales contienen E. coli, 3 ampollas con micobacterias de tuberculosis (cepa avirulenta) a una concentración de 10 ² /ml; 3 ampollas con células de una cepa similar a una concentración de 10 ⁴ /ml; 2 ampollas con micobacterias no tuberculosas M. avium-intracellulare y M. kansasii a una concentración de 10 ⁵ /ml.

Las pruebas enviadas para la evaluación de calidad externa son previamente probadas en dos laboratorios independientes con amplia experiencia en este campo.

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