Células madre neurales

La evidencia experimental de la posibilidad de regeneración de las células del SNC se obtuvo mucho antes del descubrimiento de las células madre embrionarias en estudios que mostraron la presencia de células en el neocórtex, el hipocampo y los bulbos olfatorios del cerebro de ratas adultas que capturan 3H-timidina, es decir, son capaces de sintetizar y dividir proteínas. En la década de 1960 del siglo pasado, se asumió que estas células eran precursoras de neuronas y estaban directamente involucradas en los procesos de aprendizaje y memoria. Un poco más tarde, se reveló la presencia de sinapsis en neuronas formadas de novo y aparecieron los primeros trabajos sobre el uso de células madre embrionarias para inducir neurogénesis in vitro. A finales del siglo XX, los experimentos con la diferenciación dirigida de células madre embrionarias en células progenitoras neuronales, neuronas dopaminérgicas y serotoninérgicas, condujeron a una revisión de las ideas clásicas sobre la capacidad de las células nerviosas de los mamíferos para regenerarse. Los resultados de numerosos estudios han demostrado de forma convincente tanto la realidad de la reestructuración de las redes neuronales como la presencia de neurogénesis a lo largo de todo el período de vida postnatal del organismo mamífero.

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Fuentes de células madre neuronales

Las células madre neurales humanas se aíslan durante intervenciones en la región subventricular de los ventrículos laterales y el giro dentado del hipocampo. Estas células forman neuroesferas (esferas neurales) en cultivo. Tras la dispersión y preformación de estas últimas, se forman todos los tipos celulares principales del sistema nervioso central o, en un medio especial, nuevas microesferas. En cultivos en suspensión de tejido disociado aislado de las regiones periventriculares del cerebro embrionario, también se forman neuroesferas.

Los marcadores de células cerebrales inmaduras incluyen nestina, beta-tubulina III (marcador de linaje neuronal), vimentina, GFAP y NCAM, que se identifican inmunocitoquímicamente mediante anticuerpos monoclonales. Nestina (proteína de neurofilamento intermedio tipo IV) es expresada por células neuroectodérmicas multipotentes. Esta proteína se utiliza para identificar y aislar células progenitoras neuroepiteliales multipotentes del SNC mediante anticuerpos monoclonales Rat-401, que pueden detectar hasta el 95% de las células del tubo neural en embriones de rata en el undécimo día de gestación. Nestina no se expresa en descendientes diferenciados de células madre neurales, pero está presente en células progenitoras neurales tempranas, neuronas postmitóticas y neuroblastos tempranos. Este marcador se ha utilizado para identificar células progenitoras neuroepiteliales y para demostrar la existencia de células madre en el SNC. La vimentina (proteína del neurofilamento intermedio tipo III) se expresa en células progenitoras neurales y gliales, así como en neuronas, fibroblastos y células musculares lisas. Por lo tanto, ambos marcadores inmunocitoquímicos carecen de la especificidad necesaria para identificar por separado las células madre neurales y las progenitoras. La beta-tubulina III establece la dirección neuronal de la diferenciación de las células madre, mientras que los astrocitos tipo I se identifican mediante la expresión de GFAP, y los oligodendrocitos expresan específicamente galactocerebrósido (Ga!C).

El FGF2 y el EGF actúan como mitógenos para las células progenitoras neuronales, favoreciendo la proliferación de células progenitoras indiferenciadas en cultivo con la formación de neuroesferas. La tasa de división de las células madre neuronales aumenta significativamente bajo la influencia del FGF2, así como con el uso de una combinación de FGF2 + EGF. Los efectos proliferativos del FGF2 están mediados por los receptores FGF2-R1. La heparina aumenta la afinidad de unión del receptor FGF2 y potencia drásticamente su efecto mitogénico sobre las células neuroepiteliales. En las primeras etapas de la embriogénesis, los receptores FGF2 se expresan en el telencéfalo de la rata, mientras que en etapas posteriores su localización se limita a la zona ventricular. El pico de expresión de FGF2-R1 en las células postmitóticas se observa al finalizar el período de neurogénesis temprana. El período inicial del desarrollo del telencéfalo se caracteriza por un bajo nivel de expresión del receptor EGF, principalmente en las células de la región ventral. En etapas posteriores de la embriogénesis, la expresión del receptor EGF-R aumenta en dirección dorsal. En el cerebro de roedores, el EGF presenta una alta afinidad por el receptor del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta-R), al que se une preferentemente. Los datos sobre la disgenesia cortical del prosencéfalo que se produce en el período tardío de la embriogénesis y la ontogénesis posnatal, la disminución de la función del prosencéfalo, la muerte celular cortical y la ectopia hipocampal en ratones con el gen del receptor de EGF inactivado proporcionan evidencia indirecta del papel funcional del EGF-R. Además, la presencia de TGF-α en el medio nutritivo es absolutamente necesaria para la formación de neuroesferas. Tras la eliminación de los factores de crecimiento del medio acondicionado, las células dejan de dividirse y experimentan una diferenciación espontánea con la formación de neuronas, astrocitos y oligodendroblastos.

Teniendo esto en cuenta, la reagregación de células madre disociadas y el cultivo de neuroesferas se llevan a cabo en medios nutritivos que contienen EGF y FGF básico o FGF2, pero sin añadir suero. Se ha demostrado que el EGF induce la proliferación de células madre de la zona subependimaria de los ventrículos laterales, y el FGF básico promueve la proliferación de células madre del cuerpo estriado, el hipocampo, el neocórtex y el nervio óptico del cerebro maduro. La combinación de EGF y FGF básico es absolutamente necesaria para la proliferación activa de células madre aisladas del epéndimo del tercer y cuarto ventrículos del prosencéfalo, así como del canal espinal de la médula espinal torácica y lumbar.

Tras la disociación, la suspensión de células madre neurales se cultiva en placas de plástico o multipocillos sin sustrato adhesivo para aumentar el tamaño de las nuevas neuroesferas formadas, lo que suele tardar unas tres semanas. El método de dispersión múltiple y reproducción de neuroesferas permite obtener un número suficiente de clones lineales de células madre multipotentes para el trasplante intracerebral. Este principio también es la base para la creación de un banco de células madre aisladas del cerebro embrionario humano. Su clonación a largo plazo (varios años) permite obtener líneas estables de células madre neurales, a partir de las cuales se forman neuronas catecolaminérgicas durante la diferenciación inducida.

Si las neuroesferas no se dispersan ni se cultivan sobre sustratos adhesivos en medios carentes de factores de crecimiento, las células madre proliferantes comienzan a diferenciarse espontáneamente para formar células precursoras neuronales y gliales que expresan marcadores de todos los tipos de células nerviosas: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulina III (neuronas), GFAP (astrocitos) y CalC, O4 (oligodendrocitos). A diferencia de las células de ratón y rata, las neuronas representan más del 40% de todas las células diferenciadas en cultivos de células madre neuronales humanas (del 1 al 5% en roedores), pero se forman significativamente menos oligodendrocitos, lo cual es muy importante desde el punto de vista de la terapia celular de enfermedades desmielinizantes. El problema se soluciona añadiendo medio de cultivo B104, que estimula la formación de células productoras de mielina.

Al cultivar células progenitoras neuronales del cerebro de embriones humanos en un medio que contiene EGF, FGF básico y LIF, el número de células precursoras de linaje neuronal se multiplica por 10 millones. Las células expandidas in vitro conservan la capacidad de migrar y diferenciarse en elementos neuronales y gliales tras el trasplante al cerebro de ratas adultas. Sin embargo, in vivo, el número de divisiones de células precursoras multipotentes es limitado. Se ha observado repetidamente que el límite de Hayflick para una célula madre neuronal adulta (unas 50 mitosis) sigue siendo inalcanzable, incluso experimentalmente: las células en forma de neuroesferas conservan sus propiedades solo durante 7 meses y solo después de 8 pases. Se cree que esto se debe a las peculiaridades de sus métodos de dispersión durante el pase (tripsinización o acción mecánica), que reducen drásticamente la actividad proliferativa de las células debido a la interrupción de los contactos intercelulares. De hecho, si en lugar de la dispersión se utiliza el método de división de las neuroesferas en 4 partes, la viabilidad de las células durante el pase aumenta significativamente. Este método permite cultivar células madre neuronales humanas durante 300 días. Sin embargo, transcurrido este período, las células pierden su actividad mitótica y sufren degeneración o entran en la etapa de diferenciación espontánea con la formación de neuronas y astrocitos. Por ello, el autor considera que 30 mitosis es el número máximo de divisiones para las células madre neuronales cultivadas.

Cuando se cultivan células madre neuronales humanas in vitro, se forman predominantemente neuronas GABAérgicas. Sin condiciones especiales, las células progenitoras neuronales dan lugar a neuronas dopaminérgicas (necesarias para la terapia celular de la enfermedad de Parkinson) solo en los primeros pases, tras lo cual todas las neuronas del cultivo se componen exclusivamente de células GABAérgicas. En roedores, la IL-1 y la IL-11, así como fragmentos de membranas celulares nerviosas, LIF y GDNF, inducen la inducción de neuronas dopaminérgicas in vitro. Sin embargo, este enfoque metodológico no ha tenido éxito en humanos. No obstante, cuando se trasplantan neuronas GABAérgicas intracerebrales in vivo, bajo la influencia de factores microambientales, surgen células nerviosas con diferentes fenotipos mediadores.

La búsqueda de combinaciones de factores neurotróficos mostró que FGF2 e IL-1 inducen la formación de neuroblastos dopaminérgicos, que, sin embargo, no son capaces de producir neuronas dopaminérgicas. La diferenciación de las células madre hipocampales en neuronas glutamatérgicas excitatorias y GABA-érgicas inhibidoras ocurre bajo la influencia de las neurotrofinas, y EGF e IGF1 inducen la formación de neuronas glutamatérgicas y GABA-érgicas a partir de células progenitoras neuronales de embriones humanos. La adición secuencial de ácido retinoico y neurotrofina 3 (NT3) al cultivo aumenta significativamente la diferenciación de las células madre hipocampales cerebrales maduras en neuronas de diversa naturaleza mediadora, mientras que una combinación de factor neurotrófico derivado del cerebro (BNDF), NT3 y GDNF puede producir neuronas piramidales en cultivos hipocampales y neocorticales.

Así pues, los resultados de numerosos estudios indican, en primer lugar, que las células madre de diferentes estructuras cerebrales, bajo la influencia de factores tisulares específicos locales, son capaces de diferenciarse in vivo en fenotipos neuronales inherentes a dichas estructuras. En segundo lugar, la diferenciación inducida dirigida de células madre neuronales in vitro mediante la clonación de células progenitoras permite obtener células nerviosas y gliales con características fenotípicas específicas para el trasplante intracerebral en diversas formas de patología cerebral.

No cabe duda de que las células madre pluripotentes aisladas de embriones o del SNC adulto pueden considerarse una fuente de nuevas neuronas y utilizarse en la clínica para el tratamiento de patologías neurológicas. Sin embargo, el principal obstáculo para el desarrollo del neurotrasplante celular práctico es que la mayoría de las células madre neurales no se diferencian en neuronas tras la implantación en zonas no neurogénicas del SNC maduro. Para sortear este obstáculo, se propone un método innovador muy original que permite la obtención in vitro de una población pura de neuronas a partir de células madre neurales fetales humanas tras el trasplante al SNC de una rata madura. Los autores demuestran que la diferenciación de las células implantadas mediante este método culmina con la formación de neuronas de fenotipo colinérgico, lo cual se debe a la influencia de factores del microambiente circundante. La tecnología propuesta resulta interesante para el desarrollo de nuevos tipos de terapias basadas en células madre y la sustitución de neuronas dañadas por lesiones o enfermedades neurodegenerativas, ya que las neuronas colinérgicas desempeñan un papel fundamental en el desarrollo de las funciones motoras, de la memoria y del aprendizaje. En particular, las neuronas colinérgicas aisladas de células madre humanas pueden utilizarse para sustituir las neuronas motoras perdidas en la esclerosis lateral amiotrófica o en lesiones de la médula espinal. Actualmente, no existe información sobre métodos para producir un número significativo de neuronas colinérgicas a partir de una población de células madre preformadas con mitógenos. Los autores proponen un método bastante simple, pero eficaz, para estimular el desarrollo de células madre neuronales embrionarias humanas primarias preformadas con mitógenos en neuronas prácticamente puras tras su implantación en las zonas neurogénicas y no neurogénicas del SNC de una rata adulta. El resultado más importante de su trabajo es la conversión de un número suficientemente grande de células trasplantadas en neuronas colinérgicas tras su implantación en la membrana media y la médula espinal.

Además, para la preformación de células madre neurales de la corteza cerebral embrionaria humana de 8 semanas en neuronas colinérgicas in vitro, se propone utilizar varias combinaciones de los siguientes factores tróficos y elementos químicos: FGF básico recombinante, EGF, LIF, péptido de sonido amino-terminal de ratón (Shh-N), ácido trans-retinoico, NGF, BDNF, NT3, NT4, laminina natural y heparina de ratón. La línea original de células madre neurales humanas (K048) se mantuvo in vitro durante dos años y resistió 85 pases sin cambios en las propiedades proliferativas y de diferenciación mientras mantenía un cariotipo diploide normal. Las neuroesferas no dispersas de los pases 19-55 (semanas 38-52) se sembraron en poli-d-lisina y laminina y luego se trataron con los factores mencionados anteriormente en diferentes concentraciones, combinaciones y secuencias. La combinación de FGF básico, heparina y laminina (abreviado como FHL) produjo un efecto único. Tras un día de cultivo de células madre neurales embrionarias en medio FHL con o sin Shh-N (la combinación de Shh-N + FHL en la abreviatura SFHL), se observó una rápida proliferación de células planares grandes. Por el contrario, todos los demás protocolos de un día (como FGF básico + laminina) dieron lugar a una propagación radial limitada de células fusiformes, que no abandonaron el núcleo de las neuroesferas. Tras 6 días de activación y 10 días posteriores de diferenciación en medio con B27, se detectaron grandes células multipolares similares a neuronas en el borde de las esferas activadas con FHL. En otros grupos de protocolos, la mayoría de las células similares a neuronas permanecieron pequeñas y bipolares o unipolares. El análisis inmunocitoquímico mostró que las células bipolares o unipolares pequeñas (<20 μm) eran GABAérgicas o glutamatérgicas, mientras que la mayoría de las células multipolares grandes localizadas en el borde de las neuroesferas activadas por FHL eran colinérgicas y expresaban marcadores característicos de las neuronas colinérgicas (Islet-1 y ChAT). Algunas de estas neuronas expresaban simultáneamente sinapsina 1. Como resultado de cinco series de experimentos independientes, los autores observaron que la población total de células en las zonas de una sola capa se diferenciaba en neuronas TuJ1+ en un 45,5%, mientras que las neuronas colinérgicas (ChAT^) constituían solo el 27,8% de las células de la misma población. Tras 10 días de diferenciación adicional in vitro, además de neuronas colinérgicas, se encontró un número significativo de neuronas pequeñas en las neuroesferas activadas por FHL: glutamatérgicas (6,3%), GABAérgicas (11,3%), astrocitos (35,2%) y células nestina-positivas (18,9%). Al utilizar otras combinaciones de factores de crecimiento, se observó la ausencia de neuronas colinérgicas, y las células marginales de las neuroesferas formaron astrocitos o pequeñas neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas. La monitorización de los potenciales de reserva y activos mediante la técnica de fijación de parche de célula completa mostró que, tras siete días de activación de FHL, la mayoría de las células polipolares grandes presentaban un potencial de reposo de -29,0 ± 2,0 mV en ausencia de potencial de acción. Tras dos semanas, el potencial de reposo aumentó a -63.Se observaron 6±3,0 mV y potenciales de acción en el momento de la inducción de corrientes despolarizantes y fueron bloqueados por 1 M de tetrodotoxina, lo que indica la actividad funcional de neuronas inmaduras colinérgicas.

Los autores establecieron además que la activación de FHL o SFHL in vitro per se no resulta en la formación de neuronas maduras e intentaron establecer si las células madre preformadas con FHL o SFHL son capaces de diferenciarse en neuronas colinérgicas cuando se trasplantan al SNC de ratas maduras. Para este propósito, se inyectaron células activadas en la zona neurogénica (hipocampo) y en varias zonas no neurogénicas, incluyendo la corteza prefrontal, la membrana media y la médula espinal de ratas adultas. Las células implantadas fueron rastreadas usando el vector CAO-^^p. Se sabe que OCP marca tanto la ultraestructura celular como los procesos celulares (nivel molecular) sin fugas y puede visualizarse directamente. Además, las células madre neuronales marcadas con OCP mantienen un perfil de diferenciación neuronal y glial idéntico al de las células madre no transformadas del cerebro embrionario.

Una o dos semanas después de la implantación de 5 x 10⁻¹ ^células madre neuronales activadas y marcadas, estas se encontraron en la médula espinal o el cerebro de ratas, con células OCD+ localizadas principalmente cerca del sitio de inyección. Los procesos de migración e integración se observaron tan pronto como un mes después del trasplante. Los límites de migración variaron según el sitio de inyección: cuando se inyectaron en la corteza prefrontal, las células OCD+ se localizaron a 0,4-2 mm del sitio de inyección, mientras que en el caso de la implantación en la membrana media, el hipocampo o la médula espinal, las células migraron distancias mucho mayores, hasta 1-2 cm. Las células trasplantadas se localizaron en estructuras altamente organizadas del SNC, incluyendo la corteza frontal, la membrana media, el hipocampo y la médula espinal. Los elementos neuronales marcados con OCD fueron visibles ya en la primera semana después del trasplante, y su número aumentó significativamente un mes después de la operación. El análisis estereológico mostró una mayor tasa de supervivencia de las células implantadas en diversas estructuras del cerebro, en comparación con la médula espinal.

Se sabe que en la mayoría de los tejidos del organismo mamífero adulto se conserva una población de células madre regionales, cuya transformación en células maduras está regulada por factores tisulares específicos. La proliferación de células madre, la diferenciación de células progenitoras y la formación de fenotipos neuronales específicos de una estructura cerebral dada in vivo se expresan con mucha mayor intensidad en el cerebro embrionario, lo cual está determinado por la presencia de altas concentraciones de factores morfogenéticos del microambiente local: neurotrofinas BDNF, NGF, NT3, NT4/5 y factores de crecimiento FGF2, TGF-α, IGF1, GNDF y PDGF.

¿Dónde se encuentran las células madre neuronales?

Se ha establecido que las células madre neurales expresan la proteína fibrilar ácida glial, que entre las células maduras del linaje neural se retiene únicamente en los astrocitos. Por lo tanto, las células astrocíticas podrían ser la reserva de células madre en el SNC maduro. De hecho, se identificaron neuronas originadas a partir de precursores positivos para GFAP en los bulbos olfatorios y el giro dentado, lo que contradice las ideas tradicionales sobre la función progenitora de la glía radial, que no expresa GFAP en el giro dentado en la edad adulta. Es posible que existan dos poblaciones de células madre en el SNC.

La localización de las células madre en la zona subventricular sigue siendo incierta. Según algunos autores, las células ependimarias forman clones esféricos en cultivo que no son verdaderas neuroesferas (como los clones de células subependimarias), ya que solo pueden diferenciarse en astrocitos. Por otro lado, tras el marcaje fluorescente o viral de las células ependimarias, el marcador se detecta en las células de la capa subependimaria y los bulbos olfatorios. Dichas células marcadas in vitro forman neuroesferas y se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Además, se ha demostrado que aproximadamente el 5 % de las células del epéndimo expresan marcadores madre: nestina, Notch-1 y Mussashi-1. Se supone que el mecanismo de la mitosis asimétrica está asociado con la distribución desigual del receptor de membrana Notch-1, como resultado de lo cual este último permanece en la membrana de la célula hija localizada en la zona ependimaria, mientras que la célula madre que migra a la capa subependimaria se ve privada de este receptor. Desde este punto de vista, la zona subependimaria puede considerarse como un colector de precursores progenitores de neuronas y glía formados a partir de células madre de la capa ependimaria. Según otros autores, solo las células gliales se forman en las partes caudales de la zona subventricular, y la fuente de neurogénesis son las células de la parte rostral-lateral. En la tercera variante, las partes anterior y posterior de la zona subventricular de los ventrículos laterales reciben un potencial neurogénico equivalente.

La cuarta variante de la organización de la reserva de células madre en el sistema nervioso central parece preferible, según la cual se distinguen tres tipos principales de células progenitoras neuronales en la zona subventricular: A, B y C. Las células A expresan marcadores neuronales tempranos (PSA-NCAM, TuJl) y están rodeadas de células B, que se identifican como astrocitos mediante la expresión de antígenos. Las células C, al no tener características antigénicas de neuronas o glía, tienen una alta actividad proliferativa. El autor ha demostrado convincentemente que las células B son precursoras de células A y neuronas de novo de los bulbos olfatorios. Durante la migración, las células A están rodeadas por hebras de células progenitoras neuronales, lo que difiere significativamente del mecanismo de migración de los neuroblastos posmitóticos a lo largo de la glía radial en el cerebro embrionario. La migración termina en los bulbos olfatorios con la división mitótica de las células A y B, cuyos derivados se incorporan a las capas de células granulares y a la capa glomerular de la zona olfatoria del cerebro.

El cerebro embrionario en desarrollo carece de células ependimarias diferenciadas, y las paredes ventriculares contienen células madre proliferantes de las zonas germinal y subventricular ventricular, donde migran los neuroblastos y glioblastos primarios. Con base en esto, algunos autores creen que la región subependimaria del cerebro maduro contiene tejido neural germinal embrionario reducido consistente en astrocitos, neuroblastos y células no identificadas. Las células madre neurales verdaderas constituyen menos del 1% de las células en la zona germinal de la pared ventricular lateral. En parte por esta razón, y también en conexión con los datos de que los astrocitos de la zona subependimaria son precursores de células madre neurales, no se excluye la posibilidad de transdiferenciación de elementos gliales astrocíticos con la adquisición de características fenotípicas neuronales.

El principal obstáculo para una solución definitiva al problema de la localización de células madre neurales in vivo es la falta de marcadores específicos para estas células. Sin embargo, desde un punto de vista práctico, resultan muy interesantes los informes que indican que se aislaron células madre neurales de regiones del SNC que no contienen zonas subependimarias: el tercer y cuarto ventrículos del prosencéfalo, el canal espinal de las regiones torácica y lumbar de la médula espinal. De particular importancia es el hecho de que la lesión de la médula espinal aumenta la proliferación de células madre ependimarias del canal central con la formación de células progenitoras que migran y se diferencian en astrocitos de la cicatriz gliomesodérmica. Además, también se encontraron células precursoras de astrocitos y oligodendrocitos en la médula espinal sana de ratas adultas.

Así pues, los datos de la literatura demuestran de forma convincente la presencia en el SNC de mamíferos adultos, incluyendo a los humanos, de una reserva de células madre regionales, cuya capacidad regenerativa-plástica, lamentablemente, solo permite los procesos de regeneración fisiológica con la formación de nuevas redes neuronales, pero no satisface las necesidades de regeneración reparativa. Esto plantea la tarea de buscar oportunidades para aumentar los recursos de células madre del SNC por medios exógenos, lo cual es insoluble sin una comprensión clara de los mecanismos de formación del SNC en el período embrionario.

Hoy sabemos que durante el desarrollo embrionario, las células madre del tubo neural son la fuente de tres tipos celulares: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos; es decir, las neuronas y la neuroglia se originan a partir de una única célula precursora. La diferenciación del ectodermo en grupos de células progenitoras neurales comienza bajo la influencia de los productos de los genes proneurales de la familia bHLH y se ve bloqueada por la expresión de los derivados de la proteína transmembrana del receptor de los genes de la familia Notch, que limitan la determinación y la diferenciación temprana de las células precursoras neurales. A su vez, los ligandos de los receptores Notch son las proteínas transmembrana Delta de las células vecinas, debido a cuyo dominio extracelular se llevan a cabo los contactos intercelulares directos con la interacción inductiva entre células madre.

La implementación posterior del programa de neurogénesis embrionaria no es menos compleja y, al parecer, debería ser específica para cada especie. Sin embargo, los resultados de estudios de neuroxenotrasplante indican que las células madre presentan un marcado conservadurismo evolutivo, gracias al cual las células madre neuronales humanas pueden migrar y desarrollarse al trasplantarse al cerebro de rata.

Se sabe que el SNC de los mamíferos tiene una capacidad extremadamente baja de regeneración reparativa, que se caracteriza por la ausencia de cualquier signo de la aparición de nuevos elementos celulares en el cerebro maduro para reemplazar las neuronas que murieron como resultado de una lesión. Sin embargo, en el caso del trasplante de neuroblastos, estos últimos no solo se injertan, proliferan y diferencian, sino que también son capaces de integrarse en las estructuras cerebrales y reemplazar funcionalmente las neuronas perdidas. Al trasplantar células progenitoras neuronales comprometidas, el efecto terapéutico fue significativamente menor. Se ha demostrado que estas células tienen una baja capacidad de migración. Además, las células progenitoras neuronales no reproducen la arquitectura de las redes neuronales y no se integran funcionalmente en el cerebro del receptor. En este sentido, los problemas de regeneración reparativa-plástica durante el trasplante de células madre neuronales multipotentes no preformadas se están estudiando activamente.

En el estudio de M. Aleksandrova et al. (2001), en la primera versión de los experimentos, las receptoras fueron ratas hembra sexualmente maduras y los donantes, embriones de 15 días. Se extrajo una sección de la corteza occipital cerebral de las receptoras y se trasplantó en la cavidad tejido de la presunta corteza embrionaria, suspendido mecánicamente y que contenía células madre multipotentes de las regiones ventricular y subventricular. En la segunda versión de los experimentos, se trasplantaron células madre neurales de un embrión humano de 9 semanas al cerebro de ratas sexualmente maduras. Los autores aislaron fragmentos de tejido de la región periventricular del cerebro embrionario, los colocaron en un medio nutritivo F-12 y obtuvieron una suspensión celular mediante pipeteo repetido. Posteriormente, los cultivaron en un medio NPBM especial con la adición de factores de crecimiento: FGF, EGF y NGF. Las células se cultivaron en un cultivo en suspensión hasta la formación de neuroesferas, que se dispersaron y se volvieron a sembrar en el cultivo. Tras 4 pases con un periodo de cultivo total de 12-16 días, las células se utilizaron para trasplante. Los receptores fueron crías de rata de diez días y ratas Wistar sexualmente maduras de dos meses, a las que se les inyectaron 4 μl de suspensión de células madre neurales humanas en el ventrículo lateral del cerebro sin inmunosupresión. Los resultados del trabajo mostraron que las células disociadas de la zona ventricular y subventricular del anlage embrionario de la corteza cerebral de rata continuaron su desarrollo durante el alotrasplante en el cerebro maduro; es decir, los factores del microambiente del cerebro receptor diferenciado no bloquearon el crecimiento ni la diferenciación de las células madre neurales del embrión. En las primeras etapas tras el trasplante, las células multipotentes continuaron la división mitótica y migraron activamente desde el área de trasplante al tejido cerebral del receptor. Se encontraron células embrionarias trasplantadas con un gran potencial de migración en casi todas las capas de la corteza cerebral del receptor a lo largo del trayecto del trasplante y en la sustancia blanca. La longitud del tracto migratorio de las células nerviosas fue siempre significativamente menor (hasta 680 μm) que la de los elementos gliales (hasta 3 mm). Los vasos sanguíneos y las estructuras fibrosas del cerebro sirvieron como vectores estructurales para la migración de los astrocitos, lo cual también se observó en otros estudios.

Anteriormente, se creía que la acumulación de astrocitos marcados en la zona dañada de la corteza cerebral del receptor podría estar asociada a la formación de una barrera glial entre los tejidos del trasplante y del receptor. Sin embargo, un estudio de la estructura de trasplantes celulares compactos mostró que su citoarquitectura se caracteriza por el caos, sin una distribución estratificada de las células trasplantadas. El grado de orden de las neuronas trasplantadas se aproximaba al de las células normales de la corteza cerebral solo en ausencia de una barrera glial entre los tejidos del donante y el receptor. Por lo demás, la estructura de las células trasplantadas era atípica y las propias neuronas presentaban hipertrofia. Mediante la tipificación neuroinmunoquímica de las células trasplantadas, se encontraron neuronas GABAérgicas inhibidoras en los trasplantes y se detectó la expresión de las proteínas PARV, CALB y NPY. En consecuencia, el cerebro maduro conserva factores microambientales capaces de favorecer la proliferación, la migración y la diferenciación específica de las células neuronales multipotentes.

En el cultivo de células madre humanas aisladas de la región periventricular del cerebro de embriones de 9 semanas, M. Aleksandrova et al. (2001) encontraron un gran número de células multipotentes nestina-positivas en el cuarto pase, algunas de las cuales ya se habían diferenciado in vitro y se estaban desarrollando según el tipo neuronal, lo que correspondió a los resultados de estudios de otros autores. Después del trasplante en el cerebro de ratas adultas, las células madre humanas cultivadas se dividieron mitóticamente y migraron al tejido del cerebro receptor xenogénico. En los trasplantes celulares, los autores observaron dos poblaciones de células: pequeñas y grandes. Estas últimas migraron tanto en el parénquima como a lo largo de las estructuras fibrosas del cerebro receptor a distancias insignificantes, dentro de los 300 μm. La mayor extensión de la ruta de migración (hasta 3 mm) fue característica de las células pequeñas, algunas de las cuales se diferenciaron en astrocitos, lo cual se estableció utilizando anticuerpos monoclonales para GFAP. Se encontraron ambos tipos celulares en la pared del ventrículo lateral, lo que indica que las células trasplantadas ingresaron al tracto de migración rostral. Los derivados astrocíticos de células madre neurales, tanto de humanos como de ratas, migraron predominantemente a través de los capilares sanguíneos y las estructuras fibrosas del cerebro receptor, lo cual coincide con los datos de otros autores.

El análisis de la diferenciación de células madre humanas in vivo mediante anticuerpos monoclonales contra GFAP, CALB y VIM reveló la formación de astrocitos y neuronas. A diferencia de las células de los trasplantes de rata, muchas células madre humanas fueron vimentina-positivas. En consecuencia, algunas de las células multipotentes humanas no experimentaron diferenciación. Los mismos autores demostraron posteriormente que las células madre neuronales humanas trasplantadas sin inmunosupresión sobreviven en el cerebro de rata durante 20 días después del trasplante, sin signos de agresión inmunitaria por parte de los elementos gliales del cerebro maduro.

Se ha establecido que incluso las células madre neurales de Drosophila se injertan y experimentan diferenciación en el cerebro de un taxón tan distante de los insectos como la rata. La exactitud del experimento de los autores está fuera de toda duda: las líneas transgénicas de Drosophila contenían genes para los factores neurotróficos humanos NGF, GDNF, BDNF, insertados en el vector CaSper bajo el promotor de choque térmico de Drosophila, de modo que la temperatura corporal de los mamíferos evocaba automáticamente su expresión. Los autores identificaron las células de Drosophila por el producto del gen bacteriano de la galactosidasa mediante tinción histoquímica con X-Gal. Además, resultó que las células madre neurales de Drosophila responden específicamente a los factores neurotróficos codificados por genes humanos: cuando se xenotrasplantaron células de una línea transgénica de Drosophila que contenía el gen gdnf, la síntesis de tirosina hidroxilasa en sus células madre neurales diferenciadoras aumentó bruscamente, y las células con el gen ngf produjeron activamente acetilcolinesterasa. El xenotrasplante indujo reacciones genéticamente dependientes similares en el alotrasplante de tejido neural embrionario trasplantado junto con él.

¿Significa esto que la diferenciación específica de las células madre neurales es inducida por factores neurotróficos no específicos de la especie? Según los resultados de los autores, el xenoinjerto que produce factores neurotróficos tuvo un efecto específico en el destino de los aloinjertos, que en este caso se desarrollaron más intensamente y fueron de 2 a 3 veces más grandes en tamaño que los aloinjertos introducidos en el cerebro sin la adición de xenoinjertos. En consecuencia, las células de xenoinjerto que contienen genes de neurotrofina, en particular el gen que codifica el factor neurotrófico derivado de células gliales humanas (GDNF), tienen un efecto no específico de la especie en el desarrollo del aloinjerto similar a la acción de la neurotrofina correspondiente. Se sabe que el GDNF aumenta la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo embrionario de rata y mejora el metabolismo de la dopamina por estas células, e induce la diferenciación de células positivas a la tirosina hidroxilasa, mejorando el crecimiento del axón y aumentando el tamaño del cuerpo celular neuronal. También se observan efectos similares en neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de ratas cultivadas.

Se observa una migración activa de células madre neurales humanas tras el xenotrasplante en el cerebro de ratas adultas. Se sabe que el proceso de migración y diferenciación de las células madre neurales está controlado por un conjunto de genes específicos. La señal que inicia la migración hacia la célula precursora para iniciar la diferenciación la proporciona el producto proteico del protooncogén c-ret junto con el GDNF. La siguiente señal proviene del gen mash-1, que controla la elección de la vía de desarrollo celular. Además, la reacción específica de las células en diferenciación también depende del receptor α del factor neurotrófico ciliar. Por lo tanto, dada la constitución genética completamente diferente de las células madre neurales humanas xenogénicas y las células cerebrales de rata receptoras, es necesario reconocer no solo la inespecificidad de especie de los factores neurotróficos, sino también el máximo conservadurismo evolutivo de los genes responsables de la diferenciación específica de los elementos madre neurales.

El futuro demostrará si el xenotrasplante de neuromaterial embrionario será posible en la práctica neuroquirúrgica para el tratamiento de procesos patológicos neurodegenerativos causados por la interrupción de la síntesis de mielina por los oligodendrocitos. Mientras tanto, los temas más abordados en el neurotrasplante son los relacionados con la obtención de células madre neuronales alogénicas del cerebro embrionario o maduro en cultivo, con su posterior diferenciación dirigida en neuroblastos o neuronas especializadas.

Trasplante de células madre neurales

Para estimular la proliferación y diferenciación de las células madre neurales de un organismo adulto, se puede trasplantar tejido nervioso embrionario. Es posible que las células madre del tejido nervioso embrionario aportadas con el aloinjerto puedan, por sí mismas, experimentar proliferación y diferenciación. Se sabe que, tras una lesión medular, la regeneración de los conductores nerviosos se produce mediante la elongación de los axones dañados y la brotación colateral de los axones de las prolongaciones intactas de las neuronas motoras. Los principales factores que impiden la regeneración de la médula espinal son la formación de una cicatriz de tejido conectivo en la zona dañada, los cambios distróficos y degenerativos en las neuronas centrales, la deficiencia de NGF y la presencia de productos de degradación de la mielina en la zona dañada. Se ha demostrado que el trasplante de diferentes tipos de células en la médula espinal dañada (fragmentos del nervio ciático de animales adultos, corteza occipital embrionaria, hipocampo, médula espinal, células de Schwann, astrocitos, microglia, macrófagos, fibroblastos) promueve la regeneración de los axones dañados mediante brotación y permite que los axones recién formados crezcan a través de la zona de lesión de la médula espinal. Se ha demostrado experimentalmente que el trasplante de tejido nervioso embrionario en el área de lesión de la médula espinal, a través de la acción de factores neurotróficos, acelera el crecimiento de los axones dañados, previene la formación de cicatriz glial y el desarrollo de procesos distróficos y degenerativos en las neuronas centrales, mientras que las células del tejido nervioso embrionario trasplantado sobreviven en la médula espinal, se integran con los tejidos adyacentes y promueven el crecimiento de los axones a través del área de la lesión con la formación de sinapsis dendríticas en las neuronas espinales.

Esta área de la medicina regenerativa-plástica ha alcanzado el mayor desarrollo en Ucrania gracias al trabajo del equipo científico dirigido por VI Tsymbalyuk. En primer lugar, se trata de estudios experimentales sobre la eficacia del trasplante de tejido nervioso embrionario en lesiones de médula espinal. Durante el autotrasplante del nervio periférico, los autores observaron los cambios destructivos más pronunciados en la zona de sutura distal, donde al 30.º día postoperatorio se combinaron con procesos reparadores. Durante el alotrasplante, el estado morfofuncional del nervio implantado al 30.º día se caracterizó por una destrucción pronunciada con degeneración grasa y amiloidosis en un contexto de infiltración inflamatoria focal de células linfoides con atrofia predominante de las células de Schwann. El trasplante de tejido nervioso embrionario contribuyó en gran medida a la restauración de la conductividad de la médula espinal, especialmente en animales sometidos a cirugía durante las primeras 24 horas posteriores a la lesión: en el contexto de una disminución de la intensidad de los procesos inflamatorios y destructivos, se observó hipertrofia e hiperplasia de los elementos ultraestructurales de las neuronas espinales que sintetizan proteínas y producen energía, hipertrofia e hiperplasia de los oligodendrocitos, la amplitud del potencial de acción muscular se restauró en un 50% y la velocidad de conducción del impulso en un 90%. Al evaluar la efectividad del trasplante de tejido nervioso embrionario en función de la zona de trasplante, se encontró que los mejores resultados se observaron cuando el injerto se introdujo directamente en la zona lesionada de la médula espinal. Con la transección completa de la médula espinal, el trasplante de tejido nervioso embrionario fue ineficaz. Estudios dinámicos han demostrado que el momento óptimo para realizar un trasplante de tejido nervioso embrionario son las primeras 24 horas después de la lesión de la médula espinal, mientras que realizar la cirugía durante el período de cambios isquémicos-inflamatorios secundarios pronunciados que ocurren entre el segundo y noveno día después de la lesión debe considerarse inapropiado.

Se sabe que una lesión cerebral traumática grave provoca una activación potente y prolongada de la peroxidación lipídica en las etapas inicial e intermedia del período postraumático, tanto en el tejido cerebral dañado como en el organismo en su conjunto, y también altera los procesos de metabolismo energético en el cerebro lesionado. En estas condiciones, el trasplante de tejido nervioso embrionario en el área de la lesión traumática promueve la estabilización de los procesos de peroxidación lipídica y aumenta el potencial del sistema antioxidante del cerebro y del organismo en su conjunto, mejorando su protección antirradical entre los días 35 y 60 del período postraumático. En el mismo período después del trasplante de tejido nervioso embrionario, el metabolismo energético y los procesos de fosforilación oxidativa en el cerebro se normalizan. Además, se ha demostrado que el primer día después de una lesión cerebral traumática experimental, la impedancia del tejido del hemisferio lesionado disminuye entre un 30 % y un 37 %, y la del contralateral, un 20 %, lo que indica el desarrollo de edema cerebral generalizado. En los animales sometidos a trasplante de tejido nervioso embrionario, la involución del edema se produjo significativamente más rápido: ya al séptimo día, el valor promedio de impedancia de los tejidos del hemisferio lesionado alcanzó el 97,8 % del nivel control. Además, la restauración completa de los valores de impedancia al día 30 solo se observó en los animales sometidos a trasplante de tejido nervioso embrionario.

La muerte de algunas neuronas cerebrales tras una lesión craneoencefálica grave es una de las principales causas de complicaciones postraumáticas. Las neuronas de los sistemas dopaminérgicos y noradrenérgicos del mesencéfalo y el bulbo raquídeo son especialmente sensibles a las lesiones. Una disminución de los niveles de dopamina en el complejo estriopalidal y la corteza cerebral aumenta significativamente el riesgo de desarrollar trastornos motores y mentales, así como estados epileptiformes. Una disminución de la producción de dopamina en el hipotálamo puede ser la causa de numerosos trastornos vegetativos y somáticos observados en el período postraumático tardío. Los resultados de estudios realizados en lesiones craneoencefálicas experimentales indican que el trasplante de tejido nervioso embrionario ayuda a restaurar los niveles de dopamina en el hemisferio cerebral lesionado, de dopamina y noradrenalina en el hipotálamo, y a aumentar los niveles de noradrenalina y dopamina en el mesencéfalo y el bulbo raquídeo. Además, como resultado del trasplante de tejido nervioso embrionario en el hemisferio lesionado del cerebro de animales de experimentación, el porcentaje de fosfolípidos se normaliza y el contenido de ácidos grasos aumenta (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Estos datos confirman la estimulación de los procesos regenerativos-plásticos por el tejido nervioso embrionario trasplantado e indican el efecto reparador-trófico del trasplante sobre el cerebro del receptor en su conjunto.

La experiencia clínica del personal del Instituto de Neurocirugía AP Romodanov de la Academia de Ciencias Médicas de Ucrania en el trasplante de tejido nervioso embrionario en pacientes con parálisis cerebral, una patología extremadamente compleja con disfunción motora grave, merece especial atención. Las formas clínicas de la parálisis cerebral dependen del grado de daño a las estructuras integrales responsables de la regulación del tono muscular y la formación de estereotipos motores. Actualmente, existe evidencia suficiente que respalda que los cambios patológicos en el sistema de control motor estriopallidal-tálamocortical desempeñan un papel importante en los trastornos de la función motora y el tono muscular. El enlace estriopallidal de este sistema ejerce la función de control mediante la producción de dopamina nigroestriatal. La vía directa para la implementación del control talamocortical parte de las neuronas del putamen, está mediada por el ácido gamma-aminobutírico (GABA) y la sustancia P, y se proyecta directamente a la zona motora del segmento interno del globo pálido y la sustancia negra. La vía indirecta, cuyo efecto se realiza con la participación del GABA y la encefalina, se origina en las neuronas del putamen y afecta a los núcleos de los ganglios basales a través de una secuencia de conexiones que incluye el segmento externo del globo pálido y el núcleo subtalámico. Las alteraciones en la conductividad de la vía directa causan hipocinesia, mientras que una disminución en la conductividad de las estructuras de la vía indirecta conduce a hipercinesia con los correspondientes cambios en el tono muscular. La integridad de las vías de conducción GABAérgicas en diferentes niveles en el sistema de control motor y la integración de las conexiones dopaminérgicas a nivel del putamen son esenciales para la regulación de las interacciones talamocorticales. La manifestación más común de la patología motora en diversas formas de parálisis cerebral es una violación del tono muscular y un cambio estrechamente relacionado en la actividad muscular refleja.

El trasplante de tejido nervioso embrionario en la parálisis cerebral requiere un análisis exhaustivo de la naturaleza del daño a las estructuras cerebrales. Basándose en la determinación de los niveles de dopamina y GABA en el líquido cefalorraquídeo subaracnoideo, los autores detallaron el grado de alteración de la integración de las estructuras cerebrales funcionales, lo que permitió objetivar los resultados de la intervención quirúrgica y corregir los neurotrasplantes repetidos. El tejido nervioso embrionario (material de aborto de un embrión de 9 semanas) se trasplantó al parénquima de la corteza de las circunvoluciones precentrales de los hemisferios cerebrales, dependiendo de la gravedad de los cambios atróficos. No se observaron complicaciones ni deterioro del estado de los pacientes en el postoperatorio. Se observó una dinámica positiva en el 63% de los pacientes con formas espásticas, en el 82% de los niños con forma atónico-estética y solo en el 24% de los pacientes con forma mixta de la enfermedad. Se estableció un efecto negativo de un alto nivel de neurosensibilización con la presencia de autoanticuerpos contra proteínas neuroespecíficas en los resultados de la operación. El trasplante de tejido nervioso embrionario resultó ineficaz en pacientes de 8 a 10 años o más, así como en casos de síndrome hipercinético grave y epilepsia. Clínicamente, la eficacia del trasplante de tejido nervioso embrionario en pacientes con formas espásticas de parálisis cerebral se manifestó por el desarrollo de nuevas habilidades estatomotoras y movimientos voluntarios con corrección del estereotipo motor patológico y una disminución del grado de espasticidad, posturas y actitudes patológicas. Los autores creen que el efecto positivo del trasplante de tejido nervioso embrionario se debe al efecto normalizador sobre la actividad funcional de las estructuras supraespinales implicadas en la regulación del tono postural y los movimientos voluntarios. Al mismo tiempo, los efectos clínicos positivos del trasplante de tejido nervioso embrionario se acompañan de una disminución del contenido de neurotransmisores en el líquido cefalorraquídeo subaracnoideo, lo que indica la restauración de las interacciones integrales de las estructuras cerebrales afectadas.

Existe otra forma grave de patología neurológica, el síndrome apálico, cuyo tratamiento, lamentablemente, está lejos de resolverse. El síndrome apálico es una afección polietiológica, subaguda o crónica, que se produce como resultado de lesiones orgánicas graves del sistema nervioso central (principalmente la corteza cerebral) y se caracteriza por el desarrollo de panapraxia y panagnosia con función relativamente preservada de las secciones segmentarias y del tronco, así como de las formaciones del complejo límbico-reticular cerebral. Estudios de seguimiento (de uno a tres años) han demostrado que el síndrome apálico no es un diagnóstico definitivo de daño persistente al sistema nervioso en niños, sino que se transforma en demencia orgánica o en un estado vegetativo crónico. En el Departamento de Neurocirugía Restaurativa del Instituto de Neurocirugía A.P. Romodanov de la Academia de Ciencias Médicas de Ucrania, 21 pacientes con secuelas del síndrome apálico se sometieron a trasplante de tejido nervioso embrionario. Bajo anestesia general, se utilizó una fresa de corona para realizar un orificio de trepanación sobre el área de los cambios atróficos más pronunciados revelados por tomografía computarizada o resonancia magnética. En presencia de atrofia difusa de la sustancia gris o blanca, el trasplante se introdujo en las circunvoluciones precentral y central del cerebro. Después de abrir la duramadre, se implantaron intracorticalmente fragmentos de tejido de la corteza sensoriomotora de embriones de 8 a 9 semanas utilizando un dispositivo especial. El número de muestras de tejido implantadas osciló entre 4 y 10, determinado por el tamaño del orificio de trepanación y la magnitud de los cambios locales en la sustancia cerebral. A diferencia de otros tipos de patología, en el síndrome apálico los autores buscaron implantar la mayor cantidad posible de tejido embrionario en las áreas más accesibles del cerebro. Se suturó la duramadre y se realizó cirugía plástica del defecto craneal. Durante la operación, todos los pacientes mostraron cambios significativos tanto en la corteza (atrofia, ausencia de circunvoluciones, cambio de color y pulsación de la masa encefálica) como en las meninges (engrosamiento de la duramadre, engrosamiento significativo de la aracnoidea con presencia de sus propios vasos sanguíneos, fusión de las membranas con la masa encefálica subyacente). Estos cambios fueron más pronunciados en pacientes con antecedentes de lesiones cerebrales inflamatorias. En pacientes sometidos a hipoxia del SNC, predominaron los cambios atróficos difusos en la masa encefálica, especialmente en la corteza, con un aumento del espacio subaracnoideo, sin cambios significativos en las meninges. La mitad de los pacientes presentó un aumento del sangrado de tejidos blandos, huesos y masa encefálica. Tras las operaciones, en un plazo de seis meses a tres años, la condición mejoró en 16 pacientes y se mantuvo sin cambios en cinco. Se observó una dinámica positiva tanto en la esfera motora como en la mental. El tono muscular disminuyó en diez pacientes. En 11 pacientes, la actividad motora aumentó (disminuyó la paresia).La coordinación de movimientos mejoró. En cinco niños, la capacidad de manipulación de las extremidades superiores aumentó significativamente. En cuatro pacientes, la frecuencia y la gravedad de las convulsiones epilépticas disminuyeron, y en un niño no se produjeron convulsiones durante todo el período de observación posterior a la operación. La agresividad disminuyó en dos niños; en dos pacientes con trastornos bulbares graves, la deglución mejoró; dos niños eran capaces de masticar de forma independiente dos semanas después de la operación. Se observó una disminución en la gravedad de los trastornos mentales; nueve niños se tranquilizaron después de la operación; el sueño y la atención mejoraron en siete pacientes. Tres pacientes con síndrome apálico comenzaron a reconocer a sus padres, uno a seguir instrucciones, dos a pronunciar palabras y en tres, el grado de disartria disminuyó. Los autores señalan que una notable mejoría en el estado de los pacientes comienza dos meses después de la operación, alcanza un máximo a los 5-6 meses, luego la tasa de mejoría se ralentiza y al final del año el proceso se estabiliza en el 50% de los pacientes. El efecto positivo del neurotrasplante sirvió de base para una segunda intervención en seis pacientes con secuelas de síndrome apálico, pero en el otro hemisferio cerebral. La técnica y los métodos del segundo trasplante fueron idénticos a los de la primera operación, pero el efecto clínico de esta última fue menor, aunque no se produjeron complicaciones graves ni en la primera ni en la segunda intervención quirúrgica. Según los autores, el mecanismo del efecto terapéutico del neurotrasplante se asocia al efecto neurotrófico del tejido nervioso embrionario trasplantado, que contiene una gran cantidad de sustancias de crecimiento, hormonas y otras sustancias biológicamente activas que estimulan la reparación de las neuronas dañadas y la reorganización plástica del tejido cerebral del receptor. También es posible que se produzca un efecto activador sobre la actividad de las células nerviosas que previamente se conservaban morfológicamente, pero que perdieron su actividad funcional debido a la enfermedad. Este rápido efecto neurotrófico puede explicar la mejora de las funciones bulbares en algunos niños, ya al final de la primera o segunda semana tras la operación. Se supone que, además, hacia el tercer o cuarto mes se establecen conexiones morfofuncionales entre el trasplante y el cerebro receptor, mediante las cuales el neurotrasplante reemplaza las funciones de las células cerebrales muertas, lo cual constituye el sustrato para mejorar las funciones motoras y mentales de los pacientes. Dos niños eran capaces de masticar de forma independiente dos semanas después de la operación. Se observó una disminución en la gravedad de los trastornos mentales; nueve niños se tranquilizaron después de la operación; el sueño y la atención mejoraron en siete pacientes. Tres pacientes con síndrome apálico comenzaron a reconocer a sus padres; uno, a seguir instrucciones; dos, a pronunciar palabras.En tres casos, el grado de disartria disminuyó. Los autores señalan que una notable mejoría en el estado de los pacientes comienza a los 2 meses de la operación, alcanza un máximo a los 5-6 meses, luego la tasa de mejoría se ralentiza y al final del año el proceso se estabiliza en el 50% de los pacientes. El efecto positivo del neurotrasplante sirvió de base para una segunda operación en seis pacientes con secuelas de síndrome apálico, pero en el otro hemisferio cerebral. La técnica y el método del segundo trasplante fueron idénticos a los de la primera operación, pero el efecto clínico de esta última fue menor, aunque no se presentaron complicaciones graves ni en la primera ni en la segunda intervención quirúrgica. Según los autores, el mecanismo del efecto terapéutico del neurotrasplante se asocia con el efecto neurotrófico del tejido nervioso embrionario trasplantado, que contiene una gran cantidad de sustancias de crecimiento, hormonas y otras sustancias biológicamente activas que estimulan la reparación de las neuronas dañadas y la reorganización plástica del tejido cerebral del receptor. También es posible un efecto activador sobre la actividad de las células nerviosas que previamente se conservaban morfológicamente, pero que perdieron su actividad funcional debido a la enfermedad. Precisamente el rápido efecto neurotrófico explica la mejora de las funciones bulbares en algunos niños, ya al final de la primera o segunda semana tras la cirugía. Se supone que, al tercer o cuarto mes, se establecen conexiones morfofuncionales entre el trasplante y el cerebro receptor, mediante las cuales el neurotrasplante reemplaza las funciones de las células cerebrales muertas, lo que constituye el sustrato para mejorar las funciones motoras y mentales de los pacientes. Dos niños eran capaces de masticar de forma independiente dos semanas después de la operación. Se observó una disminución de la gravedad de los trastornos mentales: nueve niños se tranquilizaron después de la operación, y el sueño y la atención mejoraron en siete pacientes. Tres pacientes con síndrome apálico comenzaron a reconocer a sus padres, uno a seguir instrucciones, dos a pronunciar palabras y en tres disminuyó el grado de disartria. Los autores señalan que una notable mejoría en el estado de los pacientes comienza a los 2 meses de la operación, alcanza su máximo a los 5-6 meses, luego la tasa de mejoría se ralentiza y al final del año el proceso se estabiliza en el 50% de los pacientes. El efecto positivo del neurotrasplante sirvió de base para una segunda operación en seis pacientes con secuelas de síndrome apálico, pero en el otro hemisferio cerebral. La técnica y el método del segundo trasplante fueron idénticos a los de la primera operación, pero el efecto clínico de esta última fue menor, aunque no se presentaron complicaciones graves ni en la primera ni en la segunda intervención quirúrgica. Según los autores,El mecanismo del efecto terapéutico del neurotrasplante se asocia al efecto neurotrófico del tejido nervioso embrionario trasplantado, que contiene una gran cantidad de sustancias de crecimiento, hormonales y biológicamente activas que estimulan la reparación de las neuronas dañadas y la reorganización plástica del tejido cerebral del receptor. También es posible un efecto activador sobre la actividad de las células nerviosas que previamente se conservaban morfológicamente, pero que perdieron su actividad funcional debido a la enfermedad. Es precisamente el rápido efecto neurotrófico lo que puede explicar la mejora de las funciones bulbares en algunos niños ya al final de la primera o segunda semana después de la cirugía. Se supone que, junto con esto, para el tercer o cuarto mes, se establecen conexiones morfofuncionales entre el trasplante y el cerebro receptor, a través de las cuales el neurotrasplante reemplaza las funciones de las células cerebrales muertas, lo cual constituye el sustrato para mejorar las funciones motoras y mentales de los pacientes. Si bien no surgieron complicaciones graves después de la primera ni de la segunda intervención quirúrgica. Según los autores, el mecanismo del efecto terapéutico del neurotrasplante se asocia al efecto neurotrófico del tejido nervioso embrionario trasplantado, que contiene una gran cantidad de sustancias de crecimiento, hormonas y otras sustancias biológicamente activas que estimulan la reparación de las neuronas dañadas y la reorganización plástica del tejido cerebral del receptor. También es posible un efecto activador sobre la actividad de las células nerviosas que previamente se conservaban morfológicamente, pero que perdieron su actividad funcional debido a la enfermedad. Es precisamente el rápido efecto neurotrófico lo que puede explicar la mejora de las funciones bulbares en algunos niños ya al final de la primera o segunda semana después de la cirugía. Se supone que, junto con esto, para el tercer o cuarto mes, se establecen conexiones morfofuncionales entre el trasplante y el cerebro receptor, a través de las cuales el neurotrasplante reemplaza las funciones de las células cerebrales muertas, lo cual constituye el sustrato para mejorar las funciones motoras y mentales de los pacientes. Si bien no se presentaron complicaciones graves después de la primera ni de la segunda intervención quirúrgica. Según los autores, el mecanismo del efecto terapéutico del neurotrasplante se asocia al efecto neurotrófico del tejido nervioso embrionario trasplantado, que contiene una gran cantidad de sustancias de crecimiento, hormonas y otras sustancias biológicamente activas que estimulan la reparación de las neuronas dañadas y la reorganización plástica del tejido cerebral del receptor. También es posible que se produzca un efecto activador sobre la actividad de las células nerviosas que previamente se conservaban morfológicamente, pero que perdieron su actividad funcional debido a la enfermedad.Es precisamente el rápido efecto neurotrófico lo que puede explicar la mejora de las funciones bulbares en algunos niños ya al final de la primera o segunda semana tras la cirugía. Se supone que, junto con esto, hacia el tercer o cuarto mes se establecen conexiones morfofuncionales entre el trasplante y el cerebro receptor, mediante las cuales el neurotrasplante reemplaza las funciones de las células cerebrales muertas, lo cual constituye el sustrato para mejorar las funciones motoras y mentales de los pacientes.

Se estudió experimentalmente el efecto del trasplante de tejido nervioso embrionario en la reorganización de las interconexiones interneuronales. Los autores estudiaron los patrones de restauración de las conexiones axónicas intermodulares en la zona de daño mecánico de la corteza cerebral en ratas blancas con y sin trasplante de tejido nervioso embrionario, utilizando el marcador lipofílico fluorescente DIL (perclorato de 1,1-dioctadecil-3,3,33'-tetrametilindocarbocianina) y escaneo láser confocal. Se descubrió que la introducción de tejido nervioso embrionario en la zona dañada asegura el crecimiento de los axones, que tras pasar por el trasplante se conectan con el tejido cerebral adyacente, mientras que sin el trasplante de tejido nervioso embrionario, la zona dañada constituye un obstáculo insalvable para el crecimiento de los axones. En este trabajo, se realizó el trasplante de neocórtex embrionario (día 15-17 de gestación). Los resultados obtenidos por los autores constituyen una prueba más de la influencia activa del trasplante de tejido nervioso embrionario en la reorganización postraumática de las relaciones interneuronales de los módulos estructurales y funcionales vecinos de la corteza cerebral. El trasplante de tejido nervioso embrionario proporciona una restauración parcial de las conexiones entre las áreas dañadas de la corteza cerebral al crear condiciones favorables para el crecimiento axonal en la zona de acción de los factores neurotróficos del trasplante. La existencia de dicho efecto se ha demostrado experimentalmente y se discute en la literatura como evidencia de la alta capacidad plástica del cerebro dañado de animales sexualmente maduros. En este sentido, el trasplante celular se considera actualmente una estrategia terapéutica óptima para restaurar la función del SNC humano dañado.

Los datos obtenidos por los autores sobre la eficiencia del uso de tejido nervioso embrionario cerebral como medio de trasplante exógeno para el crecimiento axonal confirman las perspectivas de la creación dirigida de enlaces de comunicación entre áreas cerebrales adyacentes intactas. El trabajo sobre el estudio del efecto del trasplante de tejido nervioso en la dinámica de los parámetros funcionales del sistema nervioso central parece relevante. El objetivo del trabajo fue investigar el efecto del trasplante del locus coeruleus (LC) embrionario en los índices morfofuncionales de las neuronas del LC y la actividad locomotora de los receptores. Los receptores fueron ratas Wistar hembras, y los donantes fueron embriones de 18 días de ratas de la misma línea. El trasplante de LC embrionario se realizó en la cavidad del tercer ventrículo cerebral. Histológicamente, se detectó el injerto en el 75% de los animales receptores. En los casos de injerto, el injerto estaba adyacente a la pared ventricular, ocupando entre 1/5 y 2/5 de su luz, y era viable. A los 1 y 6 meses después de la operación, el tejido nervioso trasplantado, según sus características morfológicas, representaba estructuras que habrían surgido durante su desarrollo ontogenético normal, es decir, estructuras LC. Los datos obtenidos por los autores indican que en animales a los que se trasplantó el esbozo LC embrionario, la actividad dinámica cambia y la actividad matricial de la cromatina de los núcleos de las células LC aumenta. En consecuencia, la actividad de las neuronas de su propio LC se intensifica, pero el trasplante injertado también es funcionalmente activo. Se sabe que la llamada región locomotora del mesencéfalo prácticamente coincide con la localización del LC. Los autores creen que la base para el cambio en la actividad motora de las ratas receptoras es la activación de las células LC, tanto las propias como las del trasplante, con la liberación de una gran cantidad de norepinefrina, incluso en los segmentos de la médula espinal. Por tanto, se supone que el aumento de la actividad motora en condiciones de trasplante de LC en el cerebro intacto de animales se debe a la presencia de un trasplante funcionalmente activo integrado con el cerebro del receptor y que contribuye a la activación de la actividad locomotora en ratas.

Además, se demostró que las células neuroepiteliales trasplantadas de los rudimentos embrionarios del neocórtex y la médula espinal sobreviven y se diferencian en neuroblastos, neuronas jóvenes y maduras dentro de 1-2 meses después de su trasplante en el nervio ciático dañado de ratas maduras. Al estudiar la dinámica del desarrollo de neuronas NADPH-positivas de los rudimentos embrionarios del neocórtex y la médula espinal de ratas en aloinjertos heterotópicos (embrión de rata de 15 días), se reveló el injerto del 70 al 80% de los neuroinjertos en secciones longitudinales a través de los nervios ciáticos de ratas receptoras, que dependía del período de observación. Los neuroblastos uni y bipolares con núcleos ligeros redondeados y uno o dos nucléolos comenzaron a formarse en los injertos una semana después de la cirugía, lo que fue acompañado por la formación de grupos. Los autores no pudieron detectar células que contuvieran NADPH diaforasa (NADPH-d) entre los neuroblastos. Tras 7 días, solo los elementos celulares de los vasos sanguíneos eran NADPH positivos: células endoteliales capilares en el espesor del trasplante, así como células endoteliales y musculares lisas de los vasos del nervio ciático del receptor. Dado que en las células musculares lisas vasculares la inducción de la NO sintasa (NOS) se produce bajo la influencia de la IL-1, los autores asocian la aparición de células musculares lisas NADPH positivas en los vasos sanguíneos del nervio ciático con la presencia de IL-1 sintetizada en los troncos nerviosos dañados. Se sabe que la neurogénesis, en condiciones de trasplante de rudimentos cerebrales embrionarios, se produce de forma sincrónica con el desarrollo de neuronas in situ. Los resultados de estudios morfológicos indican que la diferenciación de algunos elementos neuronales de los trasplantes siete días después del trasplante se corresponde con la diferenciación de células en partes similares del cerebro de ratas recién nacidas. Por lo tanto, en condiciones de trasplante heterotópico en el nervio periférico, las células nerviosas embrionarias trasplantadas exhiben la capacidad de sintetizar NADPH-d. En este caso, se encuentran más neuronas que contienen NADPH-d en trasplantes de médula espinal que en trasplantes de neocórtex, pero la síntesis de óxido nítrico comienza en las neuronas trasplantadas más tarde que durante el desarrollo in situ. En el SNC de los vertebrados, las células NOS-positivas aparecen ya en el período prenatal. Se cree que el NO promueve la formación de conexiones sinápticas en el cerebro en desarrollo, y la presencia de fibras aferentes nerviosas NOS-positivas que proporcionan la síntesis de NO en los neuroblastos cerebelosos estimula la migración y diferenciación de las neuronas, debido a lo cual se forma la citoarquitectura cerebral normal. Se ha establecido un papel importante del NO en la sinapsogénesis en el tectum: solo aquellas neuronas que tenían conexiones sinápticas con células retinianas resultaron ser NOS-positivas.

Se sabe que el óxido nítrico es uno de los reguladores de la actividad cerebral, formándose a partir de la arginina bajo la influencia de la NO sintasa, que posee actividad diaforasa. En el sistema nervioso central, el NO se sintetiza en las células endoteliales de los vasos sanguíneos, la microglía, los astrocitos y las neuronas de diversas partes del cerebro. Tras un traumatismo craneoencefálico, así como durante la hipoxia y la isquemia, se observa un aumento del número de neuronas que contienen NO, uno de los reguladores del flujo sanguíneo cerebral. Dada la capacidad del NO para inducir la sinapsogénesis, resulta de especial interés el estudio de la formación de células que contienen NO durante el neurotrasplante en el contexto de una lesión traumática del tejido nervioso del receptor.

No menos importante es el estudio del efecto del neurotrasplante en el estereotipo del reflejo condicionado de la conducta. En experimentos sobre el efecto del trasplante intracerebral y a distancia (entre CII y CIII) de tejido del locus coeruleus embrionario (17-19 días de gestación) en los procesos de memoria y el contenido de catecolaminas en ratas con destrucción del neocórtex frontotemporal, se demostró que el daño electrolítico a la corteza frontotemporal del cerebro altera el estereotipo de la reacción emocional refleja condicionada de evitación (memoria), debilita la actividad fisiológica, reduce el contenido de noradrenalina en la zona del neocórtex coagulado, pero aumenta su nivel en el hipotálamo, donde se observa una disminución en la concentración de adrenalina, aunque aumenta su cantidad en la sangre y las glándulas suprarrenales.

Como resultado del trasplante intracerebral de tejido del locus coeruleus embrionario, el estereotipo de la reacción de evitación emocional refleja condicionada, interrumpida por el daño electrolítico en las regiones frontotemporales de la corteza cerebral, se restablece en el 81,4% de los animales, el contenido de adrenalina en la formación reticular del mesencéfalo, el hipotálamo y el neocórtex se normaliza, e incluso aumenta su nivel en el hipocampo, lo que se combina con una disminución de la concentración de adrenalina en la sangre.

El trasplante remoto de tejido embrionario del locus coeruleus no solo restaura el estereotipo alterado de la reacción de evitación emocional del reflejo condicionado en ratas con daño electrolítico en la corteza frontotemporal, sino que también aumenta el contenido de norepinefrina y adrenalina, principalmente en el hipotálamo, la sangre, las glándulas suprarrenales y el corazón. Se supone que esto se debe a la vascularización del trasplante, la penetración de neurotransmisores en el torrente sanguíneo, su paso a través de la barrera hematoencefálica y la activación de los mecanismos de recaptación de adrenalina y norepinefrina por los tipos de captación 1, 2, 3. Los autores creen que la estabilización a largo plazo del nivel de norepinefrina bajo condiciones de injerto y funcionamiento del trasplante puede considerarse como un fenómeno de su liberación progresiva en dosis mínimas por las neuronas del locus coeruleus.

Los efectos clínicos positivos del trasplante de tejido nervioso embrionario también pueden deberse a su capacidad para influir en los procesos de neoplasia vascular, en cuya regulación participan directamente factores de crecimiento y citocinas. La vasculogénesis se activa mediante factores de crecimiento angiogénicos: factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), FGF, PDGF y TGF, que se sintetizan durante la isquemia y actúan como desencadenantes de la angiogénesis. Se ha demostrado que la disminución del potencial de crecimiento vascular ocurre durante el envejecimiento, lo cual desempeña un papel importante en la patogénesis de enfermedades como la cardiopatía coronaria y la aterosclerosis obliterante de las extremidades inferiores. La isquemia tisular también se desarrolla en muchas otras enfermedades. La introducción de factores angiogénicos en zonas isquémicas (angiogénesis terapéutica) estimula el crecimiento de los vasos sanguíneos en los tejidos isquémicos y mejora la microcirculación gracias al desarrollo de circulación colateral, lo que, a su vez, aumenta la actividad funcional del órgano afectado.

El VEGF y el FGF se consideran los más prometedores para su uso clínico. Los resultados de los primeros estudios aleatorizados fueron alentadores, especialmente si se eligieron correctamente las dosis y los métodos de administración óptimos de los factores angiogénicos. En este sentido, se realizó una evaluación experimental de la actividad angiogénica de un extracto aislado de tejido cerebral embrionario humano. El trabajo utilizó material abortado obtenido en la vigésima semana de gestación y procesado según el método de I. Maciog et al. (1979), modificado por el IC ANRF. Este fármaco es un análogo del "Suplemento para el crecimiento de células endoteliales" ("Sigma") y es una mezcla natural de factores angiogénicos humanos que incluye VEGF y FGF. Los experimentos se realizaron en ratas con modelos de isquemia de las extremidades posteriores y del tejido miocárdico. Con base en el estudio de la actividad de la fosfatasa alcalina en animales de experimentación a los que se les administró el extracto de tejido nervioso embrionario, se observó un aumento en el número de capilares por unidad de área del miocardio, tanto en secciones longitudinales como transversales del corazón. La actividad angiogénica del preparado se manifestó tanto en la administración directa a la zona isquémica como en el caso de la administración sistémica (intramuscular), lo que provocó una disminución del área media de la cicatriz postinfarto.

En cualquier variante de trasplante de tejido nervioso embrionario, es fundamental seleccionar correctamente la edad gestacional del material embrionario trasplantado. El análisis comparativo de la eficiencia de las preparaciones celulares del mesencéfalo ventral embrionario de embriones de rata de 8, 14 y 16-17 días, tres meses después del neurotrasplante intraestriatal a ratas maduras con parkinsonismo, en la prueba automatizada de asimetría motora inducida por apomorfina, reveló una eficiencia significativamente mayor en las preparaciones de células del SNC de embriones de 8 días y la menor en las de tejido nervioso embrionario de 16-17 días. Los datos obtenidos se correlacionaron con los resultados del análisis histomorfológico, en particular con el tamaño de los trasplantes, la gravedad de la reacción glial y el número de neuronas dopaminérgicas presentes en ellos.

Las diferencias en el efecto terapéutico de las células del tejido nervioso embrionario pueden estar asociadas tanto al grado de inmadurez y compromiso de las propias células como a sus diferentes respuestas a los factores de crecimiento liberados en el área del daño inducido a las neuronas dopaminérgicas. En particular, el efecto de EGF y FGF2 en el desarrollo de células madre neurales telencefálicas in vivo ocurre en diferentes etapas de la embriogénesis. Las células neuroepiteliales de embriones de ratón de 8,5 días de edad, cuando se cultivan in vitro en un medio sin suero, proliferan en presencia de FGF2, pero no de EGF, al que solo responden las poblaciones de células madre aisladas del cerebro de embriones en etapas posteriores del desarrollo. Al mismo tiempo, las células madre neurales proliferan en respuesta a cada uno de estos mitógenos y mejoran aditivamente el crecimiento en el caso de agregar EGF y FGF2 a un cultivo con una baja densidad de siembra celular. Las células madre neurales reactivas al EGF de las zonas germinales de embriones de ratón de 14,5 días se consideran descendientes lineales de las células madre neurales reactivas al FGF que aparecen por primera vez después de los 8,5 días de gestación. El fenotipo potencial de las células madre neurales y progenitoras depende del complejo efecto de su microambiente. La inmunofenotipificación de células neurales de las zonas periventricular e hipocampal de embriones humanos de 8-12 y 17-20 semanas de edad mediante citofluorometría de flujo reveló una variabilidad significativa asociada tanto a la edad gestacional como a las características constitucionales individuales del biomaterial donante. Cuando estas células progenitoras neurales se cultivan en un medio selectivo sin suero con EGF, FGF2 y NGF, las neuroesferas se forman a una velocidad que depende significativamente de la edad gestacional. Células de diferentes partes del cerebro de embriones humanos de 5 a 13 semanas de edad, cuando se cultivan brevemente con FGF2 en cultivo de monocapa sobre un sustrato de laminina en presencia de cantidades traza de factores de crecimiento, mantienen la proliferación durante 6 semanas con un alto porcentaje de células nestina-positivas contra el fondo de la formación espontánea de células con marcadores de las tres líneas de diferenciación neuronal. Las células aisladas del mesencéfalo de un embrión humano en un período de gestación superior a 13 semanas, proliferan bajo la influencia de EGF y también forman neuroesferas. Se logró un efecto sinérgico utilizando una combinación de EGF y FGF2. La proliferación más intensa de células madre neuronales con la formación de neuroesferas se observa al cultivar el tejido de la corteza cerebral de embriones humanos de 6 a 8 semanas de edad en presencia de EGF2, IGF1 y 5% de suero de caballo sobre un sustrato con fibronectina.

Cabe señalar que las preguntas sobre la edad gestacional y la sección del SNC embrionario, cuyo tejido es preferible para el neurotrasplante, permanecen abiertas. Las respuestas deben buscarse en la neurogénesis del cerebro en desarrollo, que continúa durante el período prenatal, momento en el que el epitelio del tubo neural forma una estructura multicapa. Se cree que la fuente de células madre y nuevas neuronas es la glía radial, compuesta por células alargadas con largos procesos radialmente dirigidos respecto a la pared de las vesículas cerebrales y que contactan con la superficie interna de los ventrículos y la superficie externa de la piamadre. Anteriormente, la glía radial solo cumplía la función de tracto neuronal a lo largo del cual los neuroblastos migran desde la región ventral a las secciones superficiales, y también se le atribuía un papel esquelético en el proceso de formación de la correcta organización laminar de la corteza. Hoy en día se ha establecido que, a medida que avanza el desarrollo, la glía radial se transdiferencia en astrocitos. Una parte importante de la misma en los mamíferos se reduce inmediatamente después del nacimiento, sin embargo, en aquellas especies animales en las que la glía radial se conserva hasta la edad adulta, la neurogénesis ocurre activamente en el período postnatal.

En cultivo, las células gliales radiales del neocórtex embrionario de roedores formaron neuronas y células gliales, formándose predominantemente neuronas entre los 14 y 16 días de gestación del desarrollo embrionario (el período de máxima intensidad de la neurogénesis en la corteza cerebral de ratones y ratas). En el día 18 de la embriogénesis, la diferenciación se desplazó hacia la formación de astrocitos con una disminución significativa en el número de neuronas recién formadas. El marcaje in situ de células gliales radiales con GFP permitió detectar la división asimétrica de las células marcadas en la cavidad de las vesículas cerebrales de embriones de rata de 15 a 16 días de edad con la aparición de células hijas con características inmunológicas y electrofisiológicas de neuroblastos. Cabe destacar que, según los resultados de las observaciones dinámicas, los neuroblastos emergentes utilizan la célula madre de las células gliales radiales para migrar a la superficie pial.

El marcador endógeno de la glía radial es la proteína del filamento intermedio nestina. Mediante el método de clasificación de flujo fluorescente de células marcadas con un retrovirus asociado a la GFP y expresadas bajo el control de la nestina, se demostró que las células madre del giro dentado y el hilio del hipocampo humano (el material se obtuvo durante operaciones para la epilepsia) expresan nestina. Por lo tanto, pertenecen a la glía radial, que en humanos, al igual que en otros mamíferos, se conserva únicamente en el giro dentado.

Al mismo tiempo, la eficiencia del trasplante celular está determinada no solo por la alta viabilidad de las células donantes, su potencial de diferenciación y su capacidad para reemplazar las células defectuosas, sino, en primer lugar, por su migración dirigida. La integración funcional completa de las células trasplantadas depende de su capacidad de migración, sin alterar la citoarquitectura del cerebro del receptor. Dado que la glía radial sufre una reducción casi completa en el período posnatal, era necesario determinar cómo las células donantes pueden desplazarse desde la zona de trasplante hasta el sitio del daño cerebral en receptores adultos. Existen dos variantes de migración celular al SNC que no dependen de la glía radial: el fenómeno de la migración tangencial, o el movimiento de neuroblastos durante el desarrollo de la corteza cerebral perpendicular a la red de glía radial, así como la migración en fila o en cadena. En particular, la migración de células progenitoras neuronales desde la zona subventricular rostral hasta el bulbo olfatorio se produce como una secuencia de células estrechamente adyacentes rodeadas de células gliales. Se cree que estas células utilizan células asociadas como sustrato de migración, y el principal regulador de estas interacciones intercelulares es el PSA-NCAM (molécula de adhesión celular neuronal polisialilada). Por lo tanto, la migración neuronal no requiere necesariamente la participación de la glía radial ni conexiones axónicas preexistentes. La forma extraradial del movimiento celular en una "cadena" a lo largo del tracto de migración rostral se mantiene durante toda la vida, lo que indica una posibilidad real de administración dirigida de células progenitoras neuronales trasplantadas al sistema nervioso maduro.

Existe una hipótesis sobre la presencia de una línea de células madre en la ontogénesis cerebral, según la cual, en las primeras etapas del desarrollo cerebral, la célula madre es una célula neuroepitelial que, al madurar, se transdiferencia en glía radial. En la edad adulta, la función de las células madre la desempeñan células con características astrocíticas. A pesar de varios puntos controvertidos (contradicciones respecto a las células madre del hipocampo, así como respecto a las partes profundas del cerebro que carecen de corteza estratificada y se desarrollan a partir de los tubérculos talámicos, donde la glía radial está ausente), un concepto claro y simple de un cambio consistente en el fenotipo de las células madre a lo largo de la ontogénesis resulta muy atractivo.

La influencia de los factores microambientales en la determinación y posterior diferenciación de las células neuronales se ha demostrado claramente mediante el trasplante de células madre maduras de médula espinal de rata a diferentes regiones del sistema nervioso maduro. Al trasplantar células madre en el giro dentado o en la región de migración neuronal de los bulbos olfatorios, se observó una migración activa de las células trasplantadas, con la formación de numerosas neuronas. El trasplante de células madre en la médula espinal y la región del asta de Amón resultó en la formación de astrocitos y oligodendrocitos, mientras que el trasplante en el giro dentado resultó en la formación no solo de células gliales, sino también de neuronas.

En una rata adulta, el número de células en división en el giro dentado puede alcanzar varios miles al día, lo que representa menos del 1 % del número total de células granulares. Las neuronas representan entre el 50 % y el 90 % de las células, mientras que los astocitos y otros elementos gliales representan aproximadamente el 15 %. Las células restantes carecen de las características antigénicas de las neuronas y la glía, pero contienen antígenos de células endoteliales, lo que indica una estrecha relación entre la neurogénesis y la angiogénesis en el giro dentado. Quienes apoyan la posibilidad de diferenciación de las células endoteliales en células precursoras neuronales se refieren a la capacidad de las células endoteliales in vitro para sintetizar BDNF.

La velocidad de autoensamblaje de los circuitos neuronales es impresionante: durante la diferenciación, las células precursoras de las células granulares migran al giro dentado y forman prolongaciones que crecen hacia la zona SAZ del asta de Amón y forman sinapsis con neuronas glutamatérgicas piramidales e inhibidoras intercalares. Las células granulares recién creadas se integran en los circuitos neuronales existentes en un plazo de dos semanas, y las primeras sinapsis aparecen entre cuatro y seis días después de la aparición de las nuevas células. Mediante la administración frecuente de BrdU o 3H-timidina (uno de los métodos para identificar células madre adultas) a animales maduros, se encontró una gran cantidad de neuronas y astrocitos marcados en el asta de Amón, lo que indica la posibilidad de formar nuevas neuronas no solo en el giro dentado, sino también en otras partes del hipocampo. El interés por los procesos de división, diferenciación y muerte celular en el giro dentado del hipocampo del cerebro maduro se debe también a que las neuronas que se forman aquí se localizan en una de las zonas clave del hipocampo, responsable de los procesos de aprendizaje y memoria.

Así, se ha establecido hoy que las células progenitoras neurales se originan a partir de las células de la zona subependimaria del ventrículo lateral de roedores maduros. Estas migran a lo largo del tracto de migración rostral formado por células astrogliales orientadas longitudinalmente hasta el bulbo olfatorio, donde se incrustan en la capa de células granulares y se diferencian en neuronas de esta estructura. Se ha detectado la migración de células neurales progenitoras en el tracto de migración rostral de monos adultos, lo que indica la posibilidad de formar nuevas neuronas en el bulbo olfatorio de primates. Se han aislado células madre neurales del bulbo olfatorio de un humano adulto y se han transferido a líneas, cuyas células clonadas se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Se han encontrado células madre en el hipocampo del cerebro maduro de ratas, ratones, monos y humanos. Las células madre neurales de la zona subgranular de la fascia dentada son una fuente de células progenitoras que migran a las extremidades medial y lateral del hipocampo, donde se diferencian en células granulares maduras y elementos gliales. Los axones de neuronas de novo de la fascia dentada se rastrean hasta el campo CA3, lo que indica la participación de las neuronas recién formadas en la implementación de las funciones hipocampales. En las áreas de asociación del neocórtex de monos adultos, se encontraron células progenitoras neuronales que migraban desde la zona subventricular. En la capa VI del neocórtex del cerebro de ratón, se detectan nuevas neuronas piramidales entre 2 y 28 semanas después del daño inducido y la muerte de neuronas nativas de esta capa debido a la migración de células progenitoras previamente latentes de la zona subventricular. Finalmente, la realidad de la neurogénesis posnatal en el cerebro humano se evidencia por un aumento del doble en el número de neuronas corticales, que continúa durante los primeros 6 años después del nacimiento.

De gran importancia para la transplantología celular práctica es la regulación de los procesos de reproducción y diferenciación de las células madre neurales y progenitoras. Los glucocorticoides son los factores más importantes que suprimen la proliferación de estas células, ya que reducen drásticamente el número de divisiones, mientras que la extirpación de las glándulas suprarrenales, por el contrario, aumenta significativamente el número de mitosis (Gould, 1996). Cabe destacar que la morfogénesis del giro dentado en roedores es más intensa durante las dos primeras semanas de desarrollo posnatal, durante el período de ausencia de respuesta al estrés, en un contexto de marcada disminución de la producción y secreción de hormonas esteroides en la corteza suprarrenal. Los corticosteroides inhiben la migración de las células granulares: las nuevas neuronas no se incrustan en la capa granular del giro dentado, sino que permanecen en el hilio. Se supone que, al mismo tiempo, se interrumpen los procesos de formación de las conexiones sinápticas. La protección de las células frente a esta "agresión esteroidea" se lleva a cabo mediante la mínima expresión de receptores de mineralocorticoides y glucocorticoides en las células granulares proliferantes, no solo durante el desarrollo del giro dentado, sino también en animales adultos. Sin embargo, de todas las neuronas del cerebro, las del hipocampo se caracterizan por el mayor contenido de receptores de glucocorticoides, lo que provoca el efecto del estrés en el hipocampo. El estrés psicoemocional y las situaciones estresantes inhiben la neurogénesis, y el estrés crónico reduce drásticamente la capacidad de los animales para adquirir nuevas habilidades y aprender. Un efecto negativo más pronunciado del estrés crónico sobre la neurogénesis es bastante comprensible si tenemos en cuenta el estado predominantemente latente de las células madre neuronales. Al inmovilizar ratas preñadas (un factor de estrés extremadamente fuerte para los roedores), se observó que el estrés prenatal también provoca una disminución del número de células en el giro dentado e inhibe significativamente la neurogénesis. Se sabe que los glucocorticoides participan en la patogénesis de los estados depresivos, cuyo equivalente morfológico es la inhibición de la neurogénesis, la reorganización patológica de las neuronas y las conexiones interneuronales, y la muerte de las células nerviosas. Por otro lado, los agentes quimioterapéuticos antidepresivos activan la formación de neuronas de novo, lo que confirma la conexión entre los procesos de formación de nuevas neuronas en el hipocampo y el desarrollo de la depresión. Los estrógenos tienen un efecto significativo en la neurogénesis, cuyos efectos son opuestos a la acción de los glucocorticosteroides y consisten en favorecer la proliferación y viabilidad de las células progenitoras neuronales. Cabe destacar que los estrógenos aumentan significativamente la capacidad de aprendizaje de los animales. Algunos autores asocian los cambios cíclicos en el número de células granulares y su exceso en las hembras con la influencia de los estrógenos.

Se sabe que la neurogénesis está controlada por EGF, FGF y BDNF; sin embargo, los mecanismos del efecto de las señales externas sobre las células madre, provenientes de mitógenos y factores de crecimiento, no se han estudiado suficientemente. Se ha establecido que el PDGF in vitro mantiene la dirección neuronal de la diferenciación de las células progenitoras, y el factor neurotrófico ciliar (CNTF), al igual que la triyodotironina, estimula la formación de elementos predominantemente gliales: astrocitos y oligodendrocitos. La proteína activadora de la adenilato ciclasa hipofisaria (PACAP) y el péptido intestinal vasoactivo (VIP) activan la proliferación de células progenitoras neuronales, pero al mismo tiempo inhiben los procesos de diferenciación de las células hijas. Los opioides, especialmente en el caso de su exposición a largo plazo, inhiben significativamente la neurogénesis. Sin embargo, no se han identificado receptores opioides en células madre y células progenitoras neuronales del giro dentado (están presentes en neuronas en diferenciación del período embrionario), lo que impide evaluar los efectos directos de los opioides.

Las necesidades de la medicina regenerativa-plástica práctica han obligado a los investigadores a prestar especial atención al estudio de la pluripotencia y multipotencia de las células madre. La implementación de estas propiedades a nivel de células madre regionales de un organismo adulto podría, en el futuro, garantizar la producción del material necesario para trasplantes. Se ha demostrado anteriormente que la estimulación epigenética de células madre neurales permite obtener células proliferantes ya preformadas según fenotipos neurales, lo que limita su número. Al utilizar las propiedades totipotentes de una célula madre embrionaria, la proliferación hasta obtener un número suficiente de células ocurre antes que la diferenciación neural, y las células multiplicadas se convierten fácilmente en un fenotipo neural. Para obtener células madre neurales, las células madre neurales se aíslan de la masa celular interna del blastocisto y se cultivan en presencia obligatoria de LIF, lo que preserva su totipotencia y su capacidad de división ilimitada. Posteriormente, se induce la diferenciación neural de las células madre neurales mediante ácido retinoico. El trasplante de las células madre neurales resultantes al cuerpo estriado dañado por quinolina y 6-hidroxidopamina se acompaña de su diferenciación en neuronas dopaminérgicas y serotoninérgicas. Tras la inyección en los ventrículos del cerebro embrionario de rata, las células progenitoras neurales derivadas de células madre neurales migran a diversas regiones del cerebro receptor, como la corteza, el cuerpo estriado, el tabique, el tálamo, el hipotálamo y el cerebelo. Las células que permanecen en la cavidad ventricular forman estructuras epiteliales que se asemejan a un tubo neural, así como islotes individuales de tejido no neural. En el parénquima cerebral del embrión receptor, las células trasplantadas producen los tres tipos celulares principales del sistema nervioso. Algunas presentan dendritas apicales alargadas, cuerpos celulares piramidales y axones basales que se proyectan hacia el cuerpo calloso. Los astrocitos de origen donante extienden prolongaciones hacia los capilares cercanos, y los oligodendrocitos mantienen un estrecho contacto con los manguitos de mielina, participando en su formación. Así, las células progenitoras neuronales obtenidas a partir de ESC in vitro son capaces de una migración dirigida y una diferenciación regional adecuada a las señales microambientales, proporcionando neuronas y glía a muchas áreas del cerebro en desarrollo.

Algunos autores consideran la posibilidad de desdiferenciación y transdiferenciación de células madre regionales de un organismo adulto. La desdiferenciación celular en cultivo con expansión de sus potenciales se confirma indirectamente mediante datos sobre el injerto de células madre neurales de ratón en la médula ósea roja con el subsiguiente desarrollo de líneas celulares a partir de ellas, produciendo células funcionalmente activas de la sangre periférica. Además, el trasplante de células de neuroesferas genéticamente marcadas (LacZ) obtenidas del cerebro maduro o embrionario al cerebro de ratones irradiados con hematopoyesis suprimida condujo a la formación no solo de derivados neurales de células madre, sino que también causó la generación de células sanguíneas, lo que indica la pluripotencia de las células madre neurales, realizada fuera del cerebro. Por lo tanto, una célula madre neural es capaz de diferenciarse en células sanguíneas bajo la influencia de señales del microambiente de la médula ósea con transformación preliminar en una célula madre hematopoyética. Por otro lado, al trasplantar células madre hematopoyéticas de médula ósea al cerebro, se estableció su diferenciación bajo la influencia del microambiente del tejido cerebral en células gliales y neurales. En consecuencia, el potencial de diferenciación de las células madre neurales y hematopoyéticas no está limitado por la especificidad tisular. En otras palabras, factores del microambiente local, diferentes de los característicos de los tejidos cerebral y de médula ósea, pueden cambiar la dirección de la diferenciación de estas células. Se demostró que las células madre neurales introducidas en el sistema venoso de ratones irradiados crean poblaciones de células hematopoyéticas mieloides, linfoides e inmaduras en el bazo y la médula ósea. In vitro, se estableció el efecto de las proteínas morfogenéticas de médula ósea (BMP) en la supervivencia y diferenciación de las células madre neurales, determinando, como en las primeras etapas de la embriogénesis, su desarrollo en las direcciones neural o glial. En cultivos de células madre neuronales de embriones de rata de 16 días, las BMP inducen la formación de neuronas y astroglía, mientras que en cultivos de células madre derivadas de cerebro perinatal, solo se forman astrocitos. Además, las BMP suprimen la generación de oligodendrocitos, que aparecen in vitro solo con la adición de noggin, un antagonista de las BMP.

Los procesos de transdiferenciación no son específicos de cada especie: las células madre hematopoyéticas de médula ósea humana trasplantadas al cuerpo estriado de ratas maduras migran a la sustancia blanca de la cápsula externa y al neocórtex ipsilateral y contralateral, donde forman elementos celulares similares a los astrocitos (Azizi et al., 1998). Cuando se alotrasplantan células madre de médula ósea al ventrículo lateral de ratones recién nacidos, la migración de células madre hematopoyéticas se puede rastrear hasta las estructuras del prosencéfalo y el cerebelo. En el cuerpo estriado y la capa molecular del hipocampo, las células migradas se transforman en astrocitos, y en el bulbo olfatorio, la capa de células granulares internas del cerebelo y la formación reticular del tronco encefálico, forman células similares a neuronas con una reacción positiva a los neurofilamentos. Tras la administración intravenosa de células hematopoyéticas a ratones adultos, se detectaron microcitos y astrocitos marcados con GFP en el neocórtex, el tálamo, el tronco encefálico y el cerebelo.

Además, las células madre mesenquimales de la médula ósea, que dan lugar a todos los tipos de células del tejido conectivo, también pueden experimentar transdiferenciación neuronal bajo ciertas condiciones (recordemos que la fuente embrionaria del mesénquima son las células de la cresta neural). Se ha demostrado que las células estromales de la médula ósea humana y de ratón cultivadas in vitro en presencia de EGF o BDNF expresan el marcador de células progenitoras neuronales nestina, y la adición de varias combinaciones de factores de crecimiento conduce a la formación de células con marcadores de glía (GFAP) y neuronas (proteína nuclear, NeuN). Las células madre mesenquimales singénicas marcadas trasplantadas al ventrículo lateral del cerebro de ratones recién nacidos migran y se localizan en el prosencéfalo y el cerebelo sin alterar la citoarquitectura del cerebro receptor. Las células madre mesenquimales de la médula ósea se diferencian en astrocitos maduros en el cuerpo estriado y la capa molecular del hipocampo, y pueblan el bulbo olfatorio, las capas granulares del cerebelo y la formación reticular, donde se transforman en neuronas. Las células madre mesenquimales de la médula ósea humana son capaces de diferenciarse en macroglía in vitro e integrarse en las estructuras cerebrales de ratas tras el trasplante. El trasplante directo de células madre mesenquimales de la médula ósea al hipocampo de ratas adultas también se acompaña de su migración al parénquima cerebral y la diferenciación neuroglial.

Se supone que el trasplante de células madre de médula ósea podría ampliar las posibilidades de la terapia celular en enfermedades del SNC caracterizadas por una muerte patológica excesiva de neuronas. Sin embargo, cabe destacar que no todos los investigadores reconocen la transformación mutua de las células madre neuronales y hematopoyéticas, especialmente in vivo, lo que se debe nuevamente a la falta de un marcador fiable para evaluar su transdiferenciación y posterior desarrollo.

El trasplante de células madre abre nuevos horizontes para la terapia génica celular en la patología neurológica hereditaria. La modificación genética de células madre neurales implica la inserción de constructos reguladores genéticos, cuyos productos interactúan con las proteínas del ciclo celular en el modo de regulación automática. La transducción de estos genes en células progenitoras embrionarias se utiliza para multiplicar las células madre neurales. La mayoría de los clones celulares modificados genéticamente se comportan como líneas celulares estables, sin mostrar signos de transformación in vivo ni in vitro, pero presentan una marcada capacidad de inhibición de la proliferación por contacto. Tras el trasplante, las células transfectadas multiplicadas se integran en el tejido receptor sin alterar la citoarquitectura ni sufrir transformación tumoral. Las células madre neurales del donante no deforman la zona de integración y compiten por el espacio en igualdad de condiciones con las células progenitoras del huésped. Sin embargo, entre el segundo y tercer día, la intensidad de la división de las células transfectantes disminuye drásticamente, lo que corresponde a la inhibición de su proliferación por contacto in vitro. Los embriones receptores de células madre neurales no presentan anomalías en el desarrollo del sistema nervioso central; todas las áreas del cerebro en contacto con el trasplante se desarrollan con normalidad. Tras el trasplante, los clones de células madre neurales migran rápidamente desde la zona de inyección y, a menudo, traspasan las zonas embrionarias correspondientes a lo largo del tracto rostral, integrándose adecuadamente con otras áreas del cerebro. La integración de clones genéticamente modificados y líneas celulares transfectadas de células madre neurales en el cerebro del organismo huésped es característica no solo del período embrionario: estas células se implantan en numerosas áreas del sistema nervioso central del feto, el recién nacido, el adulto e incluso en el organismo receptor en edad avanzada, y demuestran capacidad para una adecuada integración y diferenciación. En particular, tras el trasplante a la cavidad ventricular cerebral, las células transfectadas migran sin dañar la barrera hematoencefálica y se convierten en componentes celulares funcionales integrales del tejido cerebral. Las neuronas del donante forman sinapsis apropiadas y expresan canales iónicos específicos. Con la integridad de la barrera hematoencefálica preservada, la astroglia, un derivado de las células madre neuronales transfectantes, extiende procesos a los vasos cerebrales, y los oligodendrocitos derivados del donante expresan la proteína básica de mielina y mielinizan los procesos neuronales.

Además, las células madre neurales se transfectan para su uso como vectores celulares. Estas construcciones vector-genéticas proporcionan una expresión estable in vivo de genes foráneos implicados en el desarrollo del sistema nervioso, o se utilizan para corregir defectos genéticos existentes, ya que los productos de estos genes son capaces de compensar diversas anomalías bioquímicas del sistema nervioso central. La alta actividad migratoria de las células madre transfectadas y su adecuada implantación en las zonas germinales de diversas áreas del cerebro en desarrollo permiten esperar una restauración completa de la deficiencia hereditaria de enzimas celulares. En el modelado del síndrome de ataxia-telangiectasia (líneas de ratones mutantes pg y pcd), las células de Purkinje desaparecen del cerebelo de animales de experimentación durante las primeras semanas de desarrollo posnatal. Se ha demostrado que la introducción de células madre neurales en el cerebro de estos animales se acompaña de su diferenciación en células de Purkinje y neuronas granulares. En mutantes pcd, los trastornos de la coordinación del movimiento se corrigen parcialmente y la intensidad del temblor se reduce. Se obtuvieron resultados similares trasplantando células madre neurales humanas clonadas a primates, en quienes se indujo la degeneración de las células de Purkinje mediante onconasa. Tras el trasplante, se encontraron células madre neurales del donante en las capas granular, molecular y de células de Purkinje del parénquima cerebeloso. Por lo tanto, la modificación genética de las células progenitoras neurales puede proporcionar una modificación estable y comprometida del fenotipo, resistente a influencias externas. Esto es especialmente importante en procesos patológicos asociados con el desarrollo de factores en el receptor que impiden la supervivencia y la diferenciación de las células del donante (p. ej., durante la agresión inmunitaria).

La mucopolisacaridosis tipo VII en humanos se caracteriza por neurodegeneración y discapacidad intelectual progresiva, que se modela en ratones mediante una mutación por deleción en el gen de la beta-glucuronidasa. Tras el trasplante de células madre neurales transfectadas que secretan beta-glucuronidasa en los ventrículos cerebrales de ratones receptores recién nacidos con defectos, las células donantes se encuentran primero en la zona terminal y luego se extienden por todo el parénquima cerebral, corrigiendo de forma estable la integridad de los lisosomas en el cerebro de los ratones mutantes. En un modelo de la enfermedad de Tay-Sachs, las células madre neurales transducidas con retrovirus, al administrarse in utero a fetos de ratón y trasplantarse a ratones recién nacidos, proporcionan una expresión eficiente de la subunidad beta de la beta-hexosaminidasa en receptores con una mutación que provoca la acumulación patológica del gangliósido beta2.

Otra área de la medicina regenerativa es la estimulación del potencial proliferativo y diferenciador de las células madre neurales del propio paciente. En particular, las células madre neurales secretan NT-3 durante la hemisección de la médula espinal y la asfixia cerebral en ratas, expresan NGF y BDNF en el tabique y los ganglios basales, tirosina hidroxilasas en el cuerpo estriado, así como reelina en el cerebelo y la proteína básica de la mielina en el cerebro.

Sin embargo, es evidente que no se presta suficiente atención a la estimulación de la neurogénesis. Algunos estudios sugieren que la carga funcional de los centros nerviosos responsables de la distinción de olores se refleja en la formación de nuevas neuronas. En ratones transgénicos con déficit de moléculas de adhesión neuronal, la disminución de la intensidad de la neurogénesis y del número de neuronas que migran a los bulbos olfatorios se combinó con un deterioro de la capacidad para distinguir olores, aunque el umbral de percepción de olores y la memoria olfativa a corto plazo no se vieron afectados. El estado funcional de las células del giro dentado desempeña un papel importante en la regulación de la neurogénesis: un debilitamiento del efecto del glutamato sobre las células granulares tras la destrucción de la corteza entorinal promueve la proliferación y diferenciación neuronal, y la estimulación de las fibras de la vía perforante (la principal vía aferente al hipocampo) inhibe la neurogénesis. Los antagonistas del receptor NMDA activan los procesos de formación de nuevas neuronas, mientras que los agonistas, por el contrario, reducen la intensidad de la neurogénesis, lo que, en efecto, se asemeja a la acción de los glucocorticosteroides. Se encuentran resultados de investigación contradictorios en la literatura: la información sobre el efecto inhibidor, comprobado experimentalmente, del neurotransmisor excitatorio glutamato sobre la neurogénesis es inconsistente con los datos sobre la estimulación de la proliferación de células progenitoras y la aparición de nuevas neuronas con un aumento de la actividad convulsiva en el hipocampo de animales con modelos experimentales de epilepsia con caína y pilocarpina. Al mismo tiempo, en el modelo tradicional de epilepsia causada por estimulación subumbral múltiple de una cierta área del cerebro (kindling) y caracterizada por una muerte neuronal menos pronunciada, la intensidad de la neurogénesis aumenta solo en la fase tardía del kindling, cuando se observa daño y muerte neuronal en el hipocampo. Se ha demostrado que, en la epilepsia, la actividad convulsiva estimula la neurogénesis con la localización anormal de nuevas neuronas granulares, muchas de las cuales aparecen no solo en el giro dentado, sino también en el hilio. Estas neuronas son de gran importancia para el desarrollo de la brotación de fibras musgosas, ya que sus axones forman colaterales inversas, normalmente ausentes, que forman numerosas sinapsis con las células granulares vecinas.

El uso de células madre neurales regionales abre nuevas perspectivas para la aplicación del trasplante celular en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas metabólicas y genéticas, enfermedades desmielinizantes y trastornos postraumáticos del sistema nervioso central. Antes de realizar el trasplante celular de reemplazo mediante uno de los métodos, se selecciona y expande ex vivo el tipo requerido de células progenitoras neurales para su posterior introducción directamente en la zona dañada del cerebro. El efecto terapéutico en este caso se debe a la sustitución de las células dañadas o a la liberación local de factores de crecimiento y citocinas. Este método de terapia regenerativa-plástica requiere el trasplante de un número suficientemente grande de células con características funcionales predeterminadas.

También deberían considerarse apropiados estudios adicionales sobre las características moleculares y el potencial regenerativo-plástico de las células madre cerebrales maduras, así como sobre la capacidad de transdiferenciación de las células madre regionales de diferentes orígenes tisulares. Actualmente, ya se ha realizado el cribado de antígenos de células madre hematopoyéticas de la médula ósea, con la determinación de una combinación de marcadores celulares capaces de transdiferenciarse en células madre progenitoras neurales (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Se han obtenido células que forman neuroesferas in vitro y neuronas al trasplantarse al cerebro de ratones inmunodeficientes recién nacidos. De interés para la xenotransplantología celular son los resultados de estudios sobre la posibilidad del trasplante cruzado de células madre en individuos de taxones evolutivamente distantes. Los resultados de la implantación de células madre neurales en el área del tumor cerebral aún no se han interpretado adecuadamente: las células trasplantadas migran activamente a través del volumen tumoral sin sobrepasar sus límites, y cuando se introducen en la parte intacta del cerebro, se observa su migración activa hacia el tumor. La cuestión del significado biológico de dicha migración sigue abierta.

Cabe señalar que el trasplante exitoso de células madre neurales, así como de otras células progenitoras neurales obtenidas de células madre neurales (CME), solo es posible mediante el uso de células progenitoras neurales altamente purificadas, ya que las células madre embrionarias indiferenciadas se transforman inevitablemente en teratomas y teratocarcinomas al trasplantarse a un receptor adulto inmunocompetente. Incluso una cantidad mínima de células poco diferenciadas en la suspensión de células del donante aumenta drásticamente la tumorigenicidad del trasplante e incrementa de forma inaceptable el riesgo de desarrollo tumoral o la formación de tejido no neural. La obtención de poblaciones homogéneas de células progenitoras neurales es posible utilizando células que surgen en ciertas etapas de la embriogénesis normal como fuente alternativa de tejido donante. Otro enfoque implica la eliminación cuidadosa de poblaciones celulares no deseadas mediante selección específica de linaje. El uso de CME para neurotrasplante tras su exposición insuficiente in vitro a factores de crecimiento también es peligroso. En este caso, no se puede descartar un fallo del programa de diferenciación neural con la formación de estructuras inherentes al tubo neural.

Hoy en día, es evidente que las células madre neurales muestran tropismo por áreas patológicamente alteradas del sistema nervioso central y poseen un pronunciado efecto regenerativo-plástico. El microambiente en el sitio de muerte celular del tejido nervioso modela la dirección de diferenciación de las células trasplantadas, compensando así la deficiencia de elementos neurales específicos en la zona dañada del SNC. En algunos procesos neurodegenerativos, surgen señales neurogénicas para la recapitulación de la neurogénesis, y las células madre neurales del cerebro maduro son capaces de responder a esta información instructiva. Numerosos datos experimentales ilustran claramente el potencial terapéutico de las células madre neurales. La administración intracisternal de un clon de células madre neurales a animales con ligadura de la arteria cerebral media (un modelo de ictus isquémico) ayuda a reducir el área y el volumen del área cerebral destructivamente alterada, especialmente en el caso del trasplante de células madre neurales junto con FGF2. Mediante inmunocitoquímica, se observa la migración de las células del donante a la zona isquémica con su posterior integración con las células cerebrales del receptor intactas. El trasplante de células inmaduras de la línea neuroepitelial murina MHP36 en el cerebro de ratas con ictus experimental mejora la función sensoriomotora, y la introducción de estas células en los ventrículos cerebrales mejora la función cognitiva. El trasplante de células hematopoyéticas preformadas neuralmente de médula ósea humana a ratas elimina la disfunción de la corteza cerebral causada por daño isquémico. En este caso, las células progenitoras neurales xenogénicas migran desde el sitio de inyección a la zona de cambios destructivos en el tejido cerebral. El trasplante intracraneal de células homólogas de médula ósea en lesiones traumáticas de la corteza cerebral en ratas conduce a la restauración parcial de la función motora. Las células del donante se injertan, proliferan, experimentan diferenciación neural en neuronas y astrocitos y migran hacia la lesión. Al inyectarse en el cuerpo estriado de ratas adultas con ictus experimental, las células madre neurales humanas clonadas reemplazan las células dañadas del SNC y restauran parcialmente la función cerebral deteriorada.

Las células madre neurales humanas se aíslan principalmente del telencéfalo embrionario, que se desarrolla mucho más tarde que las partes más caudales del tronco nervioso. Se ha demostrado la posibilidad de aislar células madre neurales de la médula espinal de un feto humano de 43 a 137 días, ya que, en presencia de EGF y FGF2, estas células forman neuroesferas y presentan multipotencia en los primeros pasajes, diferenciándose en neuronas y astrocitos. Sin embargo, el cultivo a largo plazo de células progenitoras neurales (más de un año) las priva de multipotencia; estas células solo pueden diferenciarse en astrocitos, es decir, se vuelven unipotentes. Las células madre neurales regionales pueden obtenerse mediante bulbectomía parcial y, tras su reproducción en cultivo en presencia de LIF, trasplantarse al mismo paciente con cambios neurodegenerativos en otras partes del sistema nervioso central. En la clínica, la terapia celular de reemplazo con células madre neurales se aplicó por primera vez para tratar a pacientes con accidente cerebrovascular acompañado de daño a los ganglios basales del cerebro. Como resultado del trasplante de células de donantes, se observó una mejora en el estado clínico de la mayoría de los pacientes.

Algunos autores creen que la capacidad de las células madre neurales de injertarse, migrar e integrarse en diversas áreas del tejido nervioso en caso de daño del SNC abre posibilidades ilimitadas para la terapia celular de procesos patológicos no solo locales, sino también extensivos (accidente cerebrovascular o asfixia), multifocales (esclerosis múltiple) e incluso globales (la mayoría de los trastornos metabólicos hereditarios o demencias neurodegenerativas). De hecho, cuando se trasplantan células madre neurales de ratón y humanas clonadas a animales receptores (ratones y primates, respectivamente) con degeneración de neuronas dopaminérgicas en el sistema mesostriatal inducida por la introducción de metil-fenil-tetrapiridina (modelo de la enfermedad de Parkinson) 8 meses antes del trasplante, las células madre neurales del donante se integran en el SNC del receptor. Un mes después, las células trasplantadas se localizan bilateralmente a lo largo del mesencéfalo. Algunas de las neuronas resultantes de origen del donante expresan tirosina hidrolasa en ausencia de signos de una reacción inmune al trasplante. En ratas a las que se administró 6-hidroxidopamina (otro modelo experimental de la enfermedad de Parkinson), la adaptación de las células trasplantadas al microambiente del cerebro huésped se determinó mediante las condiciones de cultivo de células madre neurales antes del trasplante. Las células madre neurales, que proliferaron rápidamente in vitro bajo la influencia del EGF, compensaron la deficiencia de neuronas dopaminérgicas en el cuerpo estriado dañado con mayor eficacia que las células de cultivos de 28 días. Los autores creen que esto se debe a la pérdida de la capacidad de percibir las señales de diferenciación correspondientes durante el proceso de división celular de las células progenitoras neurales in vitro.

En algunos estudios, se intentó aumentar la eficacia del efecto sobre los procesos de reinervación del cuerpo estriado dañado mediante el trasplante de células embrionarias del cuerpo estriado en esta zona como fuente de factores neurotróficos, junto con el trasplante simultáneo de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral. Resulta que la eficacia del neurotrasplante depende en gran medida del método de introducción del tejido nervioso embrionario. Como resultado de estudios sobre el trasplante de preparaciones de tejido nervioso embrionario al sistema ventricular del cerebro (para evitar lesiones del parénquima estriado), se obtuvo información sobre su efecto positivo sobre el defecto motor en el parkinsonismo.

Sin embargo, en otros estudios, las observaciones experimentales han demostrado que el trasplante de preparaciones de tejido nervioso embrionario del mesencéfalo ventral que contienen neuronas dopaminérgicas en el ventrículo cerebral, así como el trasplante de elementos neuronales embrionarios GABA-érgicos en el cuerpo estriado de ratas con hemiparkinsonismo, no promueve la restauración de las funciones deterioradas del sistema dopaminérgico. Por el contrario, el análisis inmunocitoquímico confirmó los datos sobre la baja tasa de supervivencia de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral trasplantadas en el cuerpo estriado de ratas. El efecto terapéutico del trasplante intraventricular de tejido nervioso embrionario del mesencéfalo ventral se observó solo bajo la condición de la implantación simultánea de una preparación de células estriatales embrionarias en el cuerpo estriado desnervado. Los autores creen que el mecanismo de este efecto está asociado con el efecto trófico positivo de los elementos GABA-érgicos del cuerpo estriado embrionario sobre la actividad dopaminérgica específica de los trasplantes intraventriculares de mesencéfalo ventral. Una reacción glial pronunciada en los trasplantes se acompañó de una ligera regresión de los parámetros de la prueba de apomorfina. Esta última, a su vez, se correlacionó con el contenido de GFAP en el suero sanguíneo, lo que indicó directamente una violación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Con base en estos datos, los autores concluyeron que el nivel de GFAP en el suero sanguíneo puede utilizarse como un criterio adecuado para evaluar el estado funcional del trasplante, y que el aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica para antígenos neuroespecíficos como la GFAP es un factor patogénico en el desarrollo del fracaso del trasplante debido al daño autoinmune del tejido nervioso del receptor.

Desde el punto de vista de otros investigadores, el injerto y la integración de las células madre neuronales tras el trasplante son estables y de por vida, ya que las células del donante se encuentran en los receptores durante al menos dos años tras el trasplante y sin una disminución significativa de su número. Los intentos de explicar esto por el hecho de que, en un estado indiferenciado, las células madre neuronales no expresan moléculas del MHC de clase I y II en un nivel suficiente para inducir una reacción de rechazo inmunitario solo pueden considerarse ciertos en relación con los precursores neuronales poco diferenciados. Sin embargo, no todas las células madre neuronales del cerebro del receptor se conservan en un estado latente inmaduro. La mayoría de ellas experimentan diferenciación, durante la cual las moléculas del MHC se expresan en su totalidad.

En particular, la insuficiente eficacia del trasplante intraestriatal de preparaciones embrionarias del mesencéfalo ventral que contienen neuronas dopaminérgicas para el tratamiento del parkinsonismo experimental se asocia con la baja tasa de supervivencia de las neuronas dopaminérgicas trasplantadas (solo entre el 5 y el 20 %), causada por la gliosis reactiva que acompaña al traumatismo local del parénquima cerebral durante el trasplante. Se sabe que el traumatismo local del parénquima cerebral y la gliosis concomitante provocan la alteración de la integridad de la barrera hematoencefálica, con la liberación de antígenos del tejido nervioso, en particular OCAR y el antígeno neuronal específico, a la sangre periférica. La presencia de estos antígenos en la sangre puede provocar la producción de anticuerpos citotóxicos específicos contra ellos y el desarrollo de agresiones autoinmunes.

V. Tsymbalyuk y coautores (2001) informan que aún se mantiene el punto de vista tradicional, según el cual el sistema nervioso central es una zona inmunológicamente privilegiada, aislada del sistema inmunitario por la barrera hematoencefálica. En su revisión bibliográfica, los autores citan varios trabajos que indican que este punto de vista no se corresponde plenamente con la esencia de los procesos inmunitarios en el cerebro de los mamíferos. Se ha establecido que las sustancias marcadas introducidas en el parénquima cerebral pueden alcanzar los ganglios linfáticos cervicales profundos y, tras la inyección intracerebral de antígenos, se forman anticuerpos específicos en el organismo. Las células de los ganglios linfáticos cervicales responden a dichos antígenos mediante proliferación, comenzando el quinto día después de la inyección. También se ha observado la formación de anticuerpos específicos durante el trasplante de piel al parénquima cerebral. Los autores de la revisión plantean varias vías hipotéticas para el transporte de antígenos desde el cerebro hasta el sistema linfático. Una de ellas es la transición de antígenos desde los espacios perivasculares al espacio subaracnoideo. Se asume que los espacios perivasculares localizados a lo largo de los grandes vasos cerebrales son el equivalente del sistema linfático cerebral. La segunda vía discurre a lo largo de las fibras blancas, a través del hueso etmoides hasta los vasos linfáticos de la mucosa nasal. Además, existe una extensa red de vasos linfáticos en la duramadre. La impermeabilidad de la barrera hematoencefálica para los linfocitos también es bastante relativa. Se ha demostrado que los linfocitos activados son capaces de producir enzimas que afectan la permeabilidad de las estructuras del "filtro inmunitario" cerebral. A nivel de las vénulas poscapilares, las células T auxiliares activadas penetran la barrera hematoencefálica intacta. La tesis sobre la ausencia de células en el cerebro que representen antígenos no resiste críticas. Actualmente, se ha demostrado convincentemente la posibilidad de que al menos tres tipos de células representen antígenos en el SNC. En primer lugar, se trata de células dendríticas derivadas de la médula ósea, localizadas en el cerebro a lo largo de los grandes vasos sanguíneos y en la sustancia blanca. En segundo lugar, los antígenos son capaces de presentar antígenos a las células endoteliales de los vasos sanguíneos cerebrales, y en asociación con antígenos MHC, esto favorece el crecimiento clonal de linfocitos T específicos para estos antígenos. En tercer lugar, las células de la microglia y la astroglia actúan como agentes presentadores de antígenos. Al participar en la formación de la respuesta inmunitaria en el sistema nervioso central, los astrocitos adquieren las propiedades de una célula efectora inmunitaria y expresan diversos antígenos, citocinas e inmunomoduladores. Al incubarse con interferón gamma (γ-INF), las células astrogliales expresan in vitro antígenos MHC de clase I y II, y los astrocitos estimulados son capaces de presentar antígenos y mantener la proliferación clonal de linfocitos.

El traumatismo tisular cerebral, la inflamación postoperatoria, el edema y los depósitos de fibrina que acompañan al trasplante de tejido nervioso embrionario crean las condiciones para una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica, con deterioro de la autotolerancia, la sensibilización y la activación de los linfocitos CD3+CD4+. La presentación de autoantígenos y aloantígenos la realizan los astrocitos y las células microgliales que responden al y-INF mediante la expresión de moléculas del MHC, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, las moléculas coestimulantes B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86), así como la secreción de IL-1a, IL-ip e y-INF.

En consecuencia, la mayor supervivencia del tejido nervioso embrionario tras el trasplante intracerebral en comparación con su administración periférica difícilmente puede asociarse con la ausencia de iniciación de la inmunidad al trasplante. Además, los monocitos, los linfocitos activados (CD3+CD8+ citotóxicos y células T cooperadoras) y las citocinas que producen, así como los anticuerpos contra los antígenos del trasplante periférico de tejido nervioso embrionario, desempeñan un papel fundamental en el proceso de rechazo. Un bajo nivel de expresión de moléculas del MHC en el tejido nervioso embrionario es crucial para crear las condiciones para una mayor resistencia de los neurotrasplantes a los procesos inmunitarios de las células T. Por ello, en el experimento, la inflamación inmunitaria tras el trasplante de tejido nervioso embrionario al cerebro se desarrolla con mayor lentitud que tras el injerto de piel. No obstante, se observa la destrucción completa de trasplantes individuales de tejido nervioso después de 6 meses. En este caso, los linfocitos T restringidos por antígenos del MHC de clase II se localizan predominantemente en la zona de trasplante (Nicholas et al., 1988). Se ha establecido experimentalmente que, durante el neurotrasplante xenológico, la depleción de linfocitos T cooperadores (L3T4+), pero no de linfocitos T citotóxicos (Lyt-2), prolonga la supervivencia del tejido nervioso de rata en el cerebro de ratones receptores. El rechazo del neurotrasplante se acompaña de su infiltración por macrófagos y linfocitos T del huésped. En consecuencia, los macrófagos del huésped y las células microgliales activadas actúan in situ como células inmunoestimulantes presentadoras de antígenos, y el aumento de la expresión de antígenos MHC de clase I del donante potencia la actividad citotóxica de los linfocitos T citotóxicos del receptor.

No tiene sentido analizar los numerosos intentos especulativos para explicar el rechazo de neurotrasplantes mediante la reacción del sistema inmunitario del receptor a las células endoteliales o elementos gliales del donante, ya que incluso las líneas puras de células progenitoras neuronales están sujetas al ataque inmunitario. Cabe destacar que la expresión de ligandos Fas por las células cerebrales que se unen a los receptores de apoptosis (moléculas Fas) en los linfocitos T que se infiltran en el cerebro e inducen su apoptosis desempeña un papel importante en los mecanismos de mayor supervivencia del trasplante en el SNC, lo cual constituye un mecanismo protector típico de los tejidos autoinmunógenos transbarrera.

Como bien señalan V. Tsymbalyuk y coautores (2001), el trasplante de tejido nervioso embrionario se caracteriza por el desarrollo de inflamación con la participación de células sensibilizadas a antígenos cerebrales y células activadas, anticuerpos, y también como resultado de la producción local de citocinas. Un papel importante en esto lo desempeña la sensibilización preexistente del organismo a los antígenos cerebrales, que ocurre durante el desarrollo de enfermedades del SNC y puede dirigirse a los antígenos del trasplante. Por esta razón, la supervivencia a largo plazo de los neurotrasplantes histoincompatibles solo se logra suprimiendo el sistema inmunitario con ciclosporina A o introduciendo anticuerpos monoclonales contra los linfocitos CD4+ del receptor.

Por lo tanto, muchos problemas del neurotrasplante siguen sin resolverse, incluidos aquellos relacionados con la compatibilidad inmunológica de los tejidos, que solo se podrán resolver después de una investigación fundamental y clínica específica.