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Células madre mesenquimales

Médico experto del artículo.

Obstetra, genetista, embriólogo
, Editor medico
Último revisado: 11.04.2020

Entre las células madre regionales, las células madre mesenquimales (MSC) ocupan un lugar especial, cuyos derivados constituyen la matriz estromal de todos los órganos y tejidos del cuerpo humano. La prioridad en la investigación de MSC pertenece a representantes de la ciencia biológica rusa.

A mediados del siglo pasado, un cultivo homogéneo de células madre de médula ósea estromales multipotentes se aisló por primera vez en el laboratorio de A. Friedenshtein. Las células madre mesenquimales unidos a un sustrato por un largo tiempo conservan una alta tasa de proliferación, y los cultivos a baja densidad de siembra después de la fijación sobre un sustrato formado de clones de células de fibroblastos que no tiene actividad fagocítica. La detención de la proliferación de MSC dio como resultado su diferenciación in vitro espontánea en células de hueso, grasa, cartílago, músculo o tejido conjuntivo. Otros estudios han permitido establecer el potencial osteogénico de las células similares a fibroblastos del estroma de la médula ósea de diversas especies de mamíferos, así como su actividad formadora de colonias. En experimentos in vivo se demostró que tanto el trasplante de hetero y ortotópico de células formadoras de colonias de fibroblastos se completa hueso, cartílago, y tejido graso fibroso formando. Dado que las células madre de la médula ósea tienen una alta capacidad de autorrenovación y una variedad de diferenciación dentro de una sola línea celular, se las ha denominado células progenitoras mesenquimatosas multipotentes.

Cabe señalar que durante 45 años de investigación fundamental de células madre mesenquimales, se han creado condiciones reales para el uso de sus derivados en la práctica clínica.

Hoy en día, no hay duda de que todos los tejidos del cuerpo humano se forman a partir de las células madre de diferentes líneas celulares como resultado de procesos de proliferación, migración, diferenciación y maduración. Sin embargo, más recientemente, se creía que las células madre en el cuerpo adulto son específicas del tejido, es decir, que son capaces de producir líneas celulares especializadas solo de los tejidos en los que están ubicadas. Esta situación conceptual fue refutada por los hechos de la transformación de células madre hematopoyéticas no solo en elementos celulares de sangre periférica, sino también en células hepáticas ovales. Además, las células madre neuronales fueron capaces de generar neuronas y elementos gliales, así como líneas precoces comprometidas de células progenitoras hematopoyéticas. A su vez, las células madre mesenquimales, que generalmente producen elementos celulares de hueso, cartílago y tejido adiposo, pueden transformarse en células madre neurales. Se supone que en el proceso de crecimiento, regeneración fisiológica y regenerativa del tejido, se generan células progenitoras no comprometidas a partir de reservas de tallo específicas de tejido. Por ejemplo, la reparación del tejido muscular puede realizarse por medio de células madre mesenquimales que migran de la médula ósea a los músculos esqueléticos.

Aunque tales células madre transversal de intercambiabilidad reconocer no todos los investigadores la posibilidad de uso clínico de las células madre mesenquimales como una fuente para el trasplante de células y el vector de célula de la información genética no ha discutido como células madre del estroma multipotenciales de médula ósea, que pueden ser relativamente fáciles de aislar y propagar en cultivo in vitro. Al mismo tiempo, en la literatura científica sigue apareciendo informes sobre el potencial de las células madre pluripotentes de la estroma de la médula ósea. A medida que los protocolos de investigación evidencia presentada, que bajo la influencia de inductores específicos de transdiferenciación de las MSC se convierten en células nerviosas, los cardiomiocitos y hepatocitos. Sin embargo, algunos científicos la oportunidad de re-activación y la expresión génica durante la embriogénesis temprana en serias dudas. Al mismo tiempo, todo el mundo entiende que si se encuentran condiciones para expandir las células madre mesenquimales multipotentes a la pluripotencia de los CES en la medicina regenerativa y plástico resuelve automáticamente muchos problemas de tipo ético, moral, religioso y legal. Además, puesto que en este caso la fuente de la capacidad de regeneración de vástago del paciente son células estromales autólogas se resuelve y el problema del rechazo inmune del trasplante de células. ¿Qué tan realistas son las perspectivas a corto futuro dirá.

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Uso de células madre mesenquimales en medicina

El uso clínica de los derivados de las células madre mesenquimales se asocia principalmente con la reducción de los defectos de los tejidos causados por lesiones térmicas extensas y profundas de la piel. Se llevó a cabo la evaluación experimental preclínica de la idoneidad de las células madre mesenquimales similares a fibroblastos alogénicos para el tratamiento de quemaduras profundas. Se muestra que las células madre mesenquimales de la médula ósea similares a fibroblastos forman una monocapa en el cultivo, lo que hace posible trasplantar ellos para optimizar la regeneración de heridas de quemaduras profundas. Los autores señalan que los fibroblastos embrionarios poseen una propiedad similar, pero la aplicación clínica de esta última está limitada por problemas éticos y legales existentes. Una quema térmica profunda con daño a todas las capas de la piel se modeló en ratas Wistar. El área de la quemadura fue del 18-20% de la superficie total de la piel. El primer grupo experimental incluyó ratas con quemaduras térmicas profundas y trasplante de células madre mesenquimales semejantes a fibroblastos alogénicos. El segundo grupo consistió en animales con quemaduras térmicas profundas y transplantación de fibroblastos embrionarios alogénicos. El tercer grupo estuvo representado por ratas de control con una quemadura térmica profunda, que no llevó a cabo la terapia celular. Una suspensión de células madre mesenquimales derivadas de fibroblastos y fibroblastos embrionarios se aplicó a una superficie de quemar la herida pipeteó en una cantidad de 2 x 10 4 células en el segundo día después de la escisión de la modelización quemadura y escara necrótica formada. Después del trasplante de células, la superficie de la quemadura se cubrió con un paño de gasa humedecido con una solución isotónica de cloruro de sodio con gentamicina. Células de médula ósea de la cerca para obtener MSCs con la posterior inducción de la línea de fibroblastos en las células madre mesenquimales producidos en ratas Wistar adultas de los fémures. Los fibroblastos embrionarios se obtuvieron de los pulmones de embriones de 14-17 días de edad. Fibroblastos de embriones y células de médula ósea para obtener una pre-MSCs se cultivaron en placas de Petri a 37 ° C en un iikubatore C02, en una atmósfera con 5% de CO2 a 95% de humedad. Los fibroblastos embrionarios se cultivaron durante 4-6 días, mientras que para la formación de una monocapa de MSC tomó de 14 a 17 días. MSCs Posteriormente mantenidos por la crioconservación como material de partida para las células madre mesenquimales derivadas de fibroblastos que se prepararon de descongelación y MSCs de cultivar durante 4 días. Número de células madre mesenquimales generada a fibroblastos es más de 3 veces el número de fibroblastos de embriones de que surjan durante el mismo período de cultivo. Para identificar las células en transtslantirovannyh queman heridas en el paso de cultivar su genoma marcó usando vector lanzadera viral basado en un adenovirus recombinante V portador del tipo 1as-2 gen que codifica ß-galactosidasa de E. Coli. Las células vivas en diversos momentos después del trasplante detectarse inmunohistoquímicamente en las criosecciones con sustrato añadido X-Gal, que da el color azul-verde característico. Como resultado de la dinámica visual, planimétrica y la condición de evaluación histológica de las lesiones por quemadura, se encontró que incluso en el 3er día después del trasplante de las células en grupos aislados aparecen diferencias significativas durante el proceso de cicatrización de la herida. Especialmente distinta, esta diferencia se produjo el séptimo día después del trasplante de células. Los animales del primer grupo, que se trasplantaron células madre mesenquimales similares a fibroblastos, herida adquirieron color intenso uniformemente de color de rosa, tejido de granulación creció en toda su superficie al nivel de la epidermis, y quemar la superficie se reduce considerablemente en tamaño. La película de colágeno formada en la superficie de la herida era algo más delgada, pero continuó cubriendo toda el área de la quemadura. Los animales del segundo grupo, que se trasplanta fibroblastos de embriones, tejido de granulación se eleva hasta el nivel de la epidermis de los bordes de la herida, pero sólo en algunos lugares, al mismo plazmoreya tiempo de la herida fue más intensa que en el grupo 1, y la película de colágeno formado inicialmente prácticamente desaparecieron. En animales que no recibieron terapia celular, en el séptimo día, la herida por quemadura era un tejido pálido, excavado y necrótico cubierto con fibrina. Se observó plasmorrea en toda la superficie de la quemadura. Histológicamente, los animales de la 1ª y 2ª grupos mostraron una disminución de la infiltración y el desarrollo de la vasculatura celular, estos síntomas de proceso regenerador incipiente han sido más severa en las ratas en el Grupo 1. En el grupo control hubo signos de infiltración celular de la herida, el patrón histológico de los vasos recién formados estaba ausente. 15-30 días del mes de observación los animales de la primera área de superficie grupo quemadura fue significativamente menor que en las ratas de otros grupos y la superficie de granulación fue más desarrollada. En los animales de la superficie quemadura segundo grupo también se disminuye en comparación con el tamaño de las heridas de quemaduras en el grupo control de ratas que era debido a la epitelización marginal. En el control de los sitios de quemaduras superficiales grupo permaneció granulaciones pálido con una rara, que aparece en ellos las arañas vasculares, islotes eran placas de fibrina continuó plazmoreya moderada través de la superficie de grabación, algo que es difícil costra desmontable se mantuvo. En general, los animales del tercer grupo también redujeron el tamaño de la herida, pero los bordes de la herida permanecieron reducidos.

Así, durante un estudio comparativo de las tasas de curación de la herida utilizando células madre mesenquimales derivadas de fibroblastos y fibroblastos fetales, y sin el uso de la terapia celular marcada aceleración de la cicatrización de la superficie de combustión como resultado de un trasplante de células madre mesenquimales derivadas de fibroblastos y fibroblastos embrionarios. Sin embargo, en el caso de utilizar células madre mesenquimatosas alogénicas de fibroblastos tasa de curación de la herida fue mayor que en el trasplante de fibroblastos embrionarios. Esto se manifiesta en la aceleración del cambio de fases de regeneración del proceso - para reducir los períodos de la infiltración celular, aumenta la tasa de proliferación de las redes vasculares, así como la formación de tejido de granulación.

Los resultados de la planimetría dinámica indican que la tasa de curación espontánea de la herida por quemadura (sin el uso de terapia celular) fue la más baja. En el 15 y 30 días después del trasplante de células madre mesenquimatosas alogénicas de fibroblastos tasa de cicatrización de la herida fue mayor que en el trasplante de fibroblastos embrionarios. Método histoquímico para la detección de beta-galactosidasa demostró que después del trasplante de células madre mesenquimales similares a fibroblastos y fibroblastos embrionarios lo largo de todo el período de observación en la superficie y profundas regeneración de las células trasplantadas heridas permanecen viables. Los autores sugieren que una mayor tasa de quemadura heridas regeneración utilizando células madre mesenquimales de fibroblastos liberación condicionado por estas células durante la maduración rostostimuliruyushih factores bioactivos.

El trasplante de queratinocitos autólogos o alogénicos y fibroblastos alogénicos para el tratamiento de heridas por quemadura y se utiliza en la clínica. Cabe señalar que el tratamiento quirúrgico de los niños con extensas quemaduras profundas es una tarea complicada debido a la alta multiplicidad de trauma y quirúrgicos intervenciones, pérdida significativa de sangre, en las diferentes reacciones utilizadas medios de infusión. Las principales dificultades en la puesta en práctica de la cirugía plástica de la piel y con extensas quemaduras profundas, el área superior al 40% de la superficie corporal, debido a la gravedad de su estado y la falta de recursos de la piel del donante. El uso de injertos de malla con gran relación de perforación no resuelve el problema, ya que la imagen después de la perforación de células epiteliziruyutsya es muy lento, y, a menudo hacer injertos de piel se lisan o seco. Tales revestimientos queman heridas como ksenokozha, aloinjertos cadavéricos, recubrimientos de película sintéticos no siempre son suficientemente eficaces, por lo que el desarrollo de nuevos métodos para el cierre de las capas superficiales quemadura de queratinocitos cultivados y fibroblastos. En particular, un método para cerrar las superficies de quemaduras utilizando allofibroblastov cultivaron proporcionar durante el trasplante pronunciado efecto estimulante sobre la proliferación epidermotsitov conservado en el borde de la herida en quemaduras, y en queratinocitos injertos con malla webs. En el trabajo de L. Budkevich y coautores (2000) se presentan los resultados de la aplicación de este método para el tratamiento de quemaduras en niños. 31 niños con trauma térmico con edades comprendidas entre 1 y 14 años estaban bajo observación. A los tres niños área total quemar heridas IIIA-B - grado IV fue de 40%, 25 - 50-70%, incluso a los tres - 71-85% de la superficie corporal. La necrosectomía quirúrgica temprana se combinó con el trasplante de todos los fibroblastos cultivados y la autodermoplastia. En la primera etapa de tratamiento se llevó a cabo la escisión de tejido necrótico, la segunda - en el trasplante de película de soporte allofibroblastov cultivada, la tercera (48 horas después del trasplante de allofibroblastov cultivadas) - eliminación de las aletas de matriz y de la piel con una relación de perforación autodermoplasty de 1: 4. Tres pacientes ingresados en la clínica con una enfermedad grave por quemaduras, todos los fibroblastos cultivados fueron trasplantados en heridas de granulación. El trasplante de alo-fibroblastos cultivados se realizó una vez en 18 niños, dos veces en 11 y tres veces en dos pacientes. El área de la superficie de la herida cubierta por el cultivo celular fue de 30 a 3500 cm2. Eficacia de allofibroblastov cultivaron evaluado por el porcentaje total de injerto de colgajos de piel, tiempo de curación de quemaduras y el número de muertes lesión térmica grave. El injerto de trasplantes fue completo en el 86% de los pacientes. Se observó una falta de apariencia parcial de los colgajos de piel en el 14% de los casos. A pesar del tratamiento en curso, seis (19.3%) niños murieron. El área total de lesión cutánea en ellos era del 40 al 70% de la superficie corporal. El trasplante de alo-fibroblastos cultivados no se relacionó con el resultado fatal de una lesión por quemadura en ningún paciente.

El análisis de los resultados del tratamiento, los autores señalan que las quemaduras anteriores incompatibles con la vida, para tratar el daño térmico de profundidad de la superficie de la piel de un 35-40% de la superficie corporal (para niños pequeños - hasta 3 años - son las quemaduras críticos profundas con una superficie de 30%, para los niños mayores público - más de 40% de la superficie corporal). Cuando el trasplante quirúrgico de la culta autodermaplasty necrectomy allofibroblastov y posterior injertos de piel con grandes quemaduras, factor de perforación IIIB - IV grado siguen siendo crítico, pero por el momento no son las perspectivas en muchos casos para salvar la vida, incluso de esas víctimas. Necrectomy quirúrgica en conjunción con el trasplante de allofibroblastov cultivaron y autodermaplasty en niños con quemaduras profundas resultó ser particularmente eficaz en pacientes con lesiones avanzadas de la piel con un déficit de sitios donantes. Táctica quirúrgica activa y el trasplante allofibroblastov culta promueven la rápida estabilización de la condición general de estos pacientes, la reducción del número de complicaciones infecciosas de la enfermedad quemadura, creando condiciones favorables para el injerto, reducen el tiempo necesario para restaurar la piel perdida y la duración del tratamiento en el hospital, lo que reduce la incidencia de muertes en pacientes con quemaduras extensas. Por lo tanto, el trasplante de allofibroblastov cultivaron seguido colgajos de piel autodermaplasty logra la recuperación en niños con quemaduras graves, que se consideraron previamente condenada.

Es ampliamente reconocido que el objetivo principal del tratamiento de una enfermedad de quemaduras es maximizar la recuperación completa y rápida de la piel dañada para evitar los efectos tóxicos resultantes, las complicaciones infecciosas y la deshidratación del cuerpo. Los resultados de la aplicación de células cultivadas dependen en gran medida de la preparación para el trasplante de la herida por quemadura. En los casos de trasplante de queratinocitos cultivados, el 55% (por área) de las células trasplantadas sobreviven en la superficie de la herida después de la necrectomía quirúrgica, mientras que en las heridas injertadas la frecuencia del injerto se reduce al 15%. Por lo tanto, el tratamiento exitoso de quemaduras extensas en la piel profunda requiere, en primer lugar, tácticas quirúrgicas activas. En presencia de lesiones por quemaduras grado IIIB-IV, la superficie de la quemadura se libera inmediatamente de los tejidos necróticos para reducir los efectos de la intoxicación y reducir el número de complicaciones de la enfermedad de quemaduras. El uso de tales tácticas es la clave para reducir el tiempo desde el momento de la quemadura hasta el cierre de las heridas y la duración de la estadía de los pacientes con quemaduras extensas en el hospital, y también reduce significativamente el número de muertes.

Los primeros informes sobre el uso exitoso de queratinocitos cultivados para cubrir la superficie quemada aparecieron a principios de los años ochenta del siglo pasado. Posteriormente, esta manipulación se llevó a cabo con la ayuda de capas de queratinocitos cultivados, obtenidos con mayor frecuencia de autocélulas, y mucho menos a menudo de aloqueratinocitos. Sin embargo, la tecnología de autoqueratinocitoplastia no permite la creación de un banco de células, mientras que el tiempo requerido para producir un injerto suficiente de queratinocitos es grande y es de 3-4 semanas. Durante este período, el riesgo de desarrollar complicaciones infecciosas y otras de la enfermedad de quemaduras aumenta bruscamente, lo que prolonga significativamente la duración total de la estadía de los pacientes en el hospital. Además, los autoqueratinocitos prácticamente no sobreviven cuando se trasplantan en heridas de quemaduras de granulación, y el alto costo de medios de crecimiento especiales y estimulantes de crecimiento de queratinocitos biológicamente activos limita significativamente su aplicación clínica. Otros métodos biotecnológicos, como la colágenoplastia, el trasplante de xenoides criopreservados y el uso de diversos revestimientos de biopolímeros aumentan la efectividad del tratamiento de quemaduras superficiales extensas pero no profundas. El método de recubrimiento de la superficie de la herida con fibroblastos cultivados es fundamentalmente diferente ya que el componente principal del grupo de células cultivadas no son los queratinocitos sino los fibroblastos.

Un requisito previo para el desarrollo del método sirvió como prueba de que los pericitos que rodean los vasos pequeños son células genitornymi mesenquimales pro capaz de transformarse en fibroblastos, que producen muchos factores de crecimiento y proporcionar la curación de heridas debido al fuerte efecto estimulante sobre la proliferación y adhesión de los queratinocitos. El uso de cultivos de fibroblastos para el cierre de superficies de la herida inmediatamente identificaron una serie de ventajas significativas de este método sobre el uso de queratinocitos cultivados. En particular, la preparación de los fibroblastos en cultivo no requiere el uso de promotores especiales medios de cultivo y de crecimiento, lo que reduce el costo de trasplante de más de 10 veces el coste de obtener queratinocitos. Los fibroblastos se someten fácilmente a pases, durante el cual pierden parcialmente sus antígenos de histocompatibilidad de superficie, que a su vez hace que sea posible utilizar para la fabricación de los trasplantes alogénicos de células y crear sus bancos. Acorta trasplantes que reciben, listos para su uso en una clínica, a partir de 3 semanas (queratinocitos) 1-2 días (para fibroblastos). Los cultivos primarios de fibroblastos se pueden obtener mediante el cultivo de células de fragmentos de piel tomadas en autodermoplasty y la siembra de células de densidad en subcultivos recepción de fibroblastos humanos es de sólo 20 × 10 3 por 1 cm 2.

Para estudiar el efecto de los fibroblastos y sus proteínas reguladoras en la proliferación y diferenciación de los queratinocitos, un análisis comparativo de las características y la morfología de la proliferación de queratinocitos sobre sustratos de colágeno de los tipos I y III y fibronectina en co-cultivo con fibroblastos humanos. Los queratinocitos humanos se aislaron a partir de fragmentos de piel de pacientes con quemaduras durante la operación de autodermoplastia. La densidad de queratinocitos era de 50 x 103 células por cm2. La eficacia clínica del trasplante de fibroblastos cultivados se evaluó en 517 pacientes. Todos los pacientes se dividieron en dos grupos: 1º - adultos afectados con quemaduras IIA, B - IV grado; 2º - niños con quemaduras profundas de IIIB - IV grado. Evaluación de la dinámica de la organización estructural y funcional de la cultivo en monocapa de fibroblastos con respecto a la función en el proceso de regeneración de los glicosaminoglicanos, fibronectina, colágeno, y permitió a los autores determinar el tercero día como las condiciones más favorables de la utilización de cultivos de fibroblastos para la producción de trasplantes. Investigación de impacto en la proliferación de fibroblastos y la diferenciación de los queratinocitos mostró que bajo fibroblastos in vitro tienen un efecto estimulante pronunciado, principalmente en los procesos de adhesión de queratinocitos, aumentando el número de células adherentes y la tasa de fijación de más de 2 veces. La estimulación de los procesos de adhesión va acompañada de un aumento en la intensidad de la síntesis de ADN y del nivel de proliferación de los queratinocitos. Además, se encontró que la presencia de fibroblastos y matriz extracelular formada por ellos es un requisito previo para la formación tonofibrillyarnogo conexiones intercelulares aparato de queratinocitos y, en última instancia, para la diferenciación de queratinocitos y la formación de membrana basal. En el tratamiento de niños con quemaduras profundas establecido la eficacia clínica de la cultura del trasplante allofibroblastov, especialmente en pacientes con lesiones extensas de los sitios donantes de piel en un déficit. Estudio morfofunktcionalnoe Complex mostró que de injerto caracterizado fibroblastos de síntesis activa de ADN, así como colágeno, fibronectina y glicosaminoglicanos, que se generan en las células de la matriz extracelular. Los autores sugieren un alto porcentaje de injerto de fibroblastos trasplantados (a 96%), una fuerte reducción en términos de su preparación (dentro de 2-3 horas en lugar de 24-48 semanas en el caso de los queratinocitos), una aceleración sustancial de la epitelización de la superficie de grabación, y una reducción significativa en el precio (en 10 veces) de la tecnología de crecimiento del injerto de los fibroblastos en comparación con el trasplante de queratinocitos. El uso de trasplante de allofibroblastov cultivaron hace que sea posible salvar las vidas de los niños con quemaduras críticos - lesión térmica más del 50% de la superficie corporal, que anteriormente se pensaba incompatible con la vida. Es de destacar que el trasplante alogénico de fibroblastos embrionarios también demostró convincentemente no sólo la regeneración más rápida de las heridas y de convalecencia pacientes con diversos grados de combustión y la zona, sino también una reducción sustancial de la mortalidad.

Fibroblastos autólogos se utilizan en este tipo de cirugía complicada y plástico como daños corrección de reemplazo de las cuerdas vocales. Normalmente se utiliza para el colágeno bovino este objeto, la duración de la acción que está limitada por su inmunogenicidad. Al ser una proteína extraña, el colágeno bovino, colagenasa sensible al destinatario y puede causar reacciones inmunes, para reducir el riesgo que se han desarrollado la tecnología de las preparaciones de colágeno, reticulado con glutaraldehído. Su ventaja es una mayor estabilidad y menor inmunogenicidad, que ha encontrado aplicación práctica en la eliminación de defectos y atrofia de las cuerdas vocales. Las inyecciones de colágeno autólogo se utilizaron por primera vez en 1995. Métodos proporcionados conservación de la estructura primaria de las fibras de colágeno autólogas, incluyendo reticulaciones intramoleculares catalizada enzimáticamente. El hecho de que las fibras de colágeno naturales son más resistentes a la degradación por proteasas que telopéptidos de colágeno reconstituidas en el que corte. Integridad telopéptidos importante para la estructura cuaternaria de las fibras de colágeno y la reticulación entre las moléculas de colágeno adyacentes. A diferencia de las preparaciones de colágeno bovino, el colágeno autólogo no causa respuestas inmunes en el receptor, pero no es suficientemente eficaz como agente llena. Corrección persistente puede lograrse debido a la producción local de trasplante autólogo de colágeno por los fibroblastos. Sin embargo, la investigación de la eficacia del trasplante de fibroblastos autólogos en la clínica reveló algunas dificultades. En el período temprano después de efecto clínico trasplante de fibroblastos fue más débil en comparación con la después de la administración de colágeno bovino. Cuando los fibroblastos autólogos cultivados no podemos excluir la posibilidad de transformación de fibroblastos normales en anormal, los llamados miofibroblastos, responsables del desarrollo de la fibrosis y la cicatrización, como se evidencia por la reducción de gel de colágeno, debido a la interacción específica de fibroblastos y fibrillas de colágeno. Además, después de la pasada en serie los fibroblastos in vitro pierden su capacidad de sintetizar proteínas de matriz extracelular.

Sin embargo, actualmente la técnica de cultivo de fibroblastos autólogos humanos ha sido eliminada experimentalmente, eliminando las desventajas anteriores y no conduciendo a la transformación oncogénica de fibroblastos normales. Los fibroblastos autólogos obtenidos mediante este método se utilizan para rellenar los defectos de los tejidos blandos de la cara. En un estudio de H. Keller y coautores (2000), 20 pacientes de 37 a 61 años con arrugas y cicatrices atróficas recibieron tratamiento. Las biopsias de piel (4 mm) región BTE que se transportaron al laboratorio en tubos estériles que contienen 10 ml de medio de cultivo (Dulbecco mikoseptikom antibiótico, piruvato y suero bovino fetal). El material se colocó dentro de 3-5 platos de cultivo con un diámetro de 60 mm y se incubó en un termostato con una atmósfera que contenía un 5% de CO2. Después de 1 semana, las células se retiraron de los platos por tripsinización y se colocaron en viales de 25 cm2. Las células se administran a pacientes en una cantidad de 4 x 107. Se observó que el efecto clínico significativo y de larga duración en pacientes con corrección de los pliegues nasolabiales, y en pacientes con cicatrices después de 7 y 12 meses después de la tercera trasplante de fibroblastos autólogos. De acuerdo con la citometría de flujo, los fibroblastos cultivados produjeron una gran cantidad de colágeno de Tipo I. En estudios in vitro, se muestra la contractilidad normal de los fibroblastos inyectables. Dos meses después de la administración subcutánea de fibroblastos cultivados en una dosis de 4 x 107 células, no se detectaron ratones desnudos. Los fibroblastos inyectables no causaron formación de cicatriz y fibrosis difusa en pacientes. Según el autor, los fibroblastos autólogos implantados pueden producir colágeno constantemente, lo que dará un efecto de rejuvenecimiento cosmético. En este caso, dado que la vida útil de las células diferenciadas es limitada, los fibroblastos tomados de un paciente joven son más efectivos que los obtenidos en personas mayores. En el futuro, se supone que la posibilidad de criopreservación de un cultivo de fibroblastos tomado de un donante joven trasplanta a un paciente anciano sus propias células jóvenes. En conclusión, no es enteramente correcta la conclusión de que los fibroblastos autólogos bajo la condición de su preservación funcional son el medio ideal de corrección de defectos en los tejidos blandos de la cara. Al mismo tiempo, el propio autor señala que en el proceso de investigación también surgieron algunas situaciones problemáticas relacionadas con el uso de un sistema autógeno de fibroblastos-colágeno. El efecto clínico a menudo fue más débil que con el uso de colágeno bovino, lo que causó decepción en los pacientes.

En general, los datos de la literatura sobre las perspectivas del uso clínico de las células madre mesenquimales parecen bastante optimistas. Se intenta utilizar células progenitoras mesenquimatosas multipotentes de médula ósea autólogas para el tratamiento de lesiones articulares degenerativas. Se llevan a cabo los primeros ensayos clínicos de células progenitoras mesenquimatosas cultivadas en el tratamiento de fracturas complejas de hueso. Autólogo y células de médula ósea del estroma mesenquimatosas alogénicas utilizadas para generar tejido de cartílago para el trasplante en la corrección de los defectos del cartílago articular debido a trauma, o lesiones autoinmunes. Se están desarrollando métodos para el uso clínico de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes para la eliminación de defectos óseos en niños con formas graves de osteogénesis incompleta causada por mutaciones del gen tipo I de colágeno. Después de mieloabelyatsii Niños-receptores de médula ósea trasplantada de donante sano de HLA compatible como la médula ósea no fraccionada puede contener una cantidad suficiente de células madre mesenquimales para reponer defecto óseo severo. Después del trasplante de médula ósea alogénica, estos niños tuvieron cambios histológicos positivos en los huesos trabeculares, un aumento en la tasa de crecimiento y una disminución en la incidencia de fracturas óseas. En algunos casos, se logra un resultado clínico positivo trasplantando médula ósea alogénica y osteoblastos estrechamente relacionados. Para el tratamiento de la fragilidad congénita de los huesos debido al desequilibrio de los osteoblastos y los osteoclastos en el tejido óseo, también se utiliza el trasplante de MSK. La restauración de la formación ósea en este caso se logra debido a la quimerización del conjunto de células estromales madre y progenitoras en el tejido óseo de los pacientes.

Los métodos de modificación genética de las células madre mesenquimatosas del donante se están mejorando para corregir los defectos genéticos de los tejidos del estroma. Se supone que las células progenitoras mesenquimales pronto serán utilizados en neurología para las células del cerebro quimerización direccional y crear un grupo de células sanas, capaces de generar enzima deficiente o factor responsable de las manifestaciones clínicas de la enfermedad. El trasplante de células madre mesenquimales se puede utilizar para restablecer el estroma de la médula ósea en pacientes con cáncer después de radio y quimioterapia, y en combinación con células de la médula ósea para restaurar la hemopoyesis. Desarrollo de la terapia de sustitución destinado a eliminar los defectos del sistema musculoesquelético usando MSCs promover la ingeniería en los biomateriales matriz de diseño o biomimics forman esqueletos que habitan en la progenie de células madre mesenquimales.

Fuentes de células madre mesenquimales

La principal fuente de las células madre mesenquimatosas son células madre hematopoyéticas de médula ósea que en los mamíferos está constantemente se diferencian en células de la sangre y del sistema inmune, mientras que las células madre mesenquimales presentan pequeñas poblaciones de células estromales de médula ósea similares a fibroblastos y ayudar a mantener el estado no diferenciado de las células madre hematopoyéticas. Bajo ciertas condiciones, las células madre mesenquimales se diferencian en células de cartílago y hueso. Cuando se colocaron en un medio de cultivo en las células estromales de la médula ósea mononucleares de baja densidad de plantación de formar colonias de células adherentes, que, de hecho, son células precursoras mesenquimatosas multipotentes de fibroblastos. Algunos autores han sugerido que la médula ósea deposita células madre mesenquimales no comprometidas, que, gracias a la capacidad de auto-renovación y alto potencial de diferenciación, proporcionan todos los tejidos del cuerpo predecesores células mesenquimales del estroma durante toda la vida organismo mamífero.

En la médula ósea, los elementos de la célula estromal forman una red que llena el espacio entre los sinusoides y el tejido óseo. El contenido de MSC latente en la médula ósea de un adulto es comparable al número de células madre hematopoyéticas y no supera el 0.01-0.001%. Las células madre mesenquimales aisladas de la médula ósea y no sometidas a cultivo carecen de moléculas adhesivas. Tales MSC no expresan CD34, ICAM, VCAM, colágeno de tipo I y III, CD44 y CD29. Por lo tanto, in vitro las células madre mesenquimales no están fijos en el sustrato de cultivo, y las células madre mesenquimáticas progenitoras derivadas más avanzados, se han formado los componentes del citoesqueleto y aparatos receptor de moléculas de adhesión celular. Las células del estroma con el fenotipo CD34 se encuentran incluso en la sangre periférica, aunque son mucho menos en la médula ósea que las células mononucleares CD34-positivas. Las células CD34 aisladas de la sangre y transferidas al cultivo se unen al sustrato y forman colonias de células similares a fibroblastos.

Se sabe que en el período embrionario la base del estroma de todos los órganos y tejidos de mamíferos y humanos surge de un conjunto común de células madre mesenquimales antes y en la etapa de organogénesis. Por lo tanto, se cree que en un cuerpo maduro, la mayoría de las células madre mesenquimales deben estar en tejido conectivo y óseo. Se ha establecido que la mayoría de los elementos celulares del estroma del tejido conectivo y óseo laxo están representados por células progenitoras comprometidas, que, sin embargo, retienen la capacidad de proliferar y formar clones in vitro. Con la introducción de tales células en el flujo sanguíneo total, más del 20% de las células progenitoras mesenquimales se implantan entre los elementos del estroma del tejido hematopoyético y los órganos parenquimatosos.

Una fuente potencial de las células madre mesenquimales es el tejido adiposo, entre los cuales de las células madre comprometidas que se encuentran en diversos grados de progenitores de adipocitos. Elementos progenitoras menos maduras de tejido adiposo - células del estroma-vascular, que es la misma como progenitores mesenquimales pluripotentes de la médula ósea pueden diferenciarse en adipocitos bajo la acción de los glucocorticoides, factor de crecimiento similar a la insulina y la insulina. En el cultivo de las células vasculares del estroma diferenciarse en adipocitos y condrocitos y células derivadas de médula ósea de tejido adiposo se están formando los adipocitos y osteoblastos.

En los músculos, también se encontraron fuentes del tallo estromal. En el cultivo primario de células aisladas de músculos esqueléticos humanos, se detectan células de forma estrellada y miotubos multinucleados. En presencia de las células estrelladas de suero de caballo proliferar in vitro sin signos de citodiferenciación y después de la adición de dexametasona al medio de cultivo de la diferenciación se caracteriza por la aparición de células elementos de células con el fenotipo de músculo esquelético y liso, hueso, cartílago, y tejido adiposo. En consecuencia, tanto las células progenitoras mesenquimáticas multipotentes comprometidas como no comprometidas están presentes en el tejido muscular humano. Se muestra que una población de células progenitoras presentes en el músculo esquelético proviene de células multipotentes no comprometidas progenitoras mesenquimales de la médula ósea, y se diferencia de las células satélite miogénica.

En el miocardio de ratas recién nacidas también encontrado células estrelladas adhesivas, apropiadas para el potencial de diferenciación de las células progenitoras mesenquimatosas multipotentes, como bajo la influencia de la dexametasona se diferencian en adipocitos, osteoblastos, condrocitos, células musculares lisas, miotubos de músculo esquelético y los miocitos cardíacos. Se ha demostrado que las células musculares lisas vasculares (pericitos) se derivan multipotentes indiferenciadas células precursoras mesenquimales perivascular. En el cultivo de células madre mesenquimales perivasculares expresar a-actina de músculo liso y receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y son capaces de diferenciar células musculares al menos lisas.

Un lugar especial en términos de reservas madre toma cartílago, muy bajo potencial reparadora de los cuales se cree que es debido a la deficiencia de las células progenitoras mesenquimatosas multipotentes o factores de diferenciación y de crecimiento. Se supone que las células progenitoras mesenquimáticas multipotentes pre-donadas a la condro y a la osteogénesis ingresan al tejido cartilaginoso de otras fuentes de tejidos.

El origen del tejido y las condiciones para la comisión de células progenitoras mesenquimales en los tendones tampoco están establecidas. Observaciones Ekspermentalnye sugieren que en las células de tendón de Aquiles del conejo postnatal temprano en cultivos primarios en el primer pasaje y retener expresión de colágeno tipo I y decorina, pero al cultivo adicional pierden tenotsitov marcadores de diferenciación.

Cabe señalar que la respuesta a la cuestión de si en efecto localiza en varios tejidos de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes están siempre presentes en su estroma, o en la piscina de tejido de células madre mesenquimales se compensa por la migración de las células madre de médula ósea del estroma, todavía se esperaba.

Además de la médula ósea y otras zonas de tejido mesenquimal de un organismo adulto, una fuente más de MSC puede ser la sangre del cordón umbilical. Se ha demostrado que la sangre de la vena del cordón umbilical contiene células que tienen características morfológicas y antigénicas similares con células progenitoras mesenquimatosas multipotentes son capaces de adherencia, y no inferior células progenitoras mesenquimatosas multipotentes de origen de la médula ósea por el potencial de diferenciación. En cultivos de células madre mesenquimatosas de la sangre del cordón umbilical detectados a partir de 5 a 10% no comprometidas progenitores mesenquimales multipotentes. Resultó que su número en la sangre del cordón es inversamente proporcional a la edad gestacional, que es una evidencia indirecta de la migración de las células progenitoras mesenquimatosas multipotentes en diversos tejidos durante el desarrollo fetal. Había primera información sobre la aplicación clínica de las células madre mesenquimales aisladas de la sangre del cordón umbilical, así como biomaterial embrionario derivado, que se basa en la conocida capacidad de las células madre fetales integrar y prizhivlyatsya función en órganos y sistemas de tejidos receptores adultos.

La búsqueda de nuevas fuentes de células madre mesenquimales

El uso de células madre mesenquimales de origen embrionario, como otras células fetales, crea una serie de problemas éticos, legales, legales y legislativos. Por lo tanto, la búsqueda de material donante celular extraembrionario continúa. Intento no tuvo éxito la aplicación clínica de los fibroblastos de piel humana, se determinó no sólo por la alta capacidad financiera de la tecnología, sino también la rápida diferenciación de fibrocitos en fibroblastos que tienen proliferación significativamente menos potencial y la producción de un número limitado de factores de crecimiento. El progreso adicional en el estudio de la biología de MSK y precursores de médula ósea mesenquimales multipotentes permitió el desarrollo de una estrategia para el uso clínico de células madre mesenquimales autólogas. La tecnología de su aislamiento, cultivo, reproducción ex vivo y diferenciación dirigida requirió, ante todo, el estudio del espectro marcador molecular de las MSCs. Su análisis mostró que en los cultivos primarios de tejido óseo humano existen varios tipos de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes. El fenotipo de pro osteoblastos se encontró en células que expresaban un marcador de células precursoras del estroma STRO-1, pero que no portaban un marcador de osteoblastos, la fosfatasa alcalina. Tales células se caracterizan por una baja capacidad para formar una matriz ósea mineralizada, así como por la ausencia de expresión de osteopontina y el receptor de la hormona paratiroidea. Los derivados de las células positivas para STRO-1 que no expresan fosfatasa alcalina están representados por osteoblastos intermedios y completamente diferenciados. Se establece que los elementos celulares de líneas clonadas de células STRO-1 positivas de huesos trabeculares humanos son capaces de diferenciarse en osteocitos maduros y adipocitos. La diferenciación dirección de estas células depende de la exposición de ácidos grasos poliinsaturados, citoquinas proinflamatorias - IL-1b y factor de necrosis tumoral a (TNF-a), así como anti-inflamatoria e inmunosupresora de TGF-b.

Más tarde se encontró que las células precursoras mesenquimatosas multipotentes carecen específico sólo a ellos fenotipo inherente, pero expresan marcadores característicos complejos, para mesenquimales, endoteliales, células epiteliales y musculares en la ausencia de expresión de células hematopoyéticas antígenos inmunofenotípicos - CD45, CD34 y CD14. Además, las células madre mesenquimales y constitutivamente producen de manera inducible hematopoyéticas y factores de crecimiento no hematopoyéticas, interleucinas, y quimiocinas, y en las células precursoras mesenquimatosas multipotentes receptores expresados para algunos factores de crecimiento y citoquinas. Entre las células del estroma conceptos básicos del cuerpo humano encontraron dormantnye o descansando células con el inmunofenotipo, casi idéntico al perfil antigénico de las células progenitoras mesenquimatosas multipotentes 5-fluorouracilo primas - esas y otras células expresan CD117, marcando "adulto" células madre.

Por lo tanto, aún no se ha establecido un marcador celular único para las células madre mesenquimales. Se supone que las células en reposo son poblaciones no comprometidos de células precursoras mesenquimatosas multipotentes, ya que no expresan marcadores de células de comprometido con osteoartritis (Cbfa-1) o la adipogénesis (PPAR-y-2). La exposición prolongada de células en reposo que proliferan lentamente al suero fetal bovino conduce a la formación de precursores diferenciados terminalmente, caracterizados por un crecimiento rápido. El crecimiento clonal de tales células mesenquimales del tallo está respaldado por FGF2. Parece que las células madre del estroma del genoma derivado de "cerrado" lo suficientemente apretado se ha informado acerca de la ausencia de diferenciación espontánea en MSCs -. Sin condiciones especiales para cometer el incluso no se convierten en células de serie mesenquimales.

Para estudiar la estructura de la población derivada mesenquimales células madre se buscaron las proteínas marcador de diferenciación en las líneas de células estromales y cultivos primarios. En las células de médula ósea ensayo de colonias clonales in vitro encontrado que cuando se someten a cultivos primarios de EGF aumenta el tamaño medio de las colonias y reduce la expresión clonal de la fosfatasa alcalina, mientras que la adición de hidrocortisona activa la expresión de la fosfatasa alcalina que es un marcador de la diferenciación osteogénica de orientación MSCs. Los anticuerpos monoclonales contra STRO-1 hacen posible separar y poblaciones de estudio de células adherentes STRO-1-positivas en un sistema heterogéneo cultivos Dexter. El espectro de citoquinas no regula solamente la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y linfoides, pero también participan en la formación, la formación y la resorción de tejido esquelético por para-, auto- y mecanismos endocrinos. Liberación mediada por receptor de mensajeros secundarios tales como cAMP, diacilglicerol, inositol trifosfato, y Ca2 + también se utilizan para el análisis de marcadores de diferentes categorías de tejidos estromales de células que expresan los receptores pertinentes. El uso de anticuerpos monoclonales como marcadores permitió establecer órganos linfoides estromales pertenecientes células reticulares para T y las zonas B-dependientes.

Durante algún tiempo, las disputas científicas continuaron en torno a la posibilidad del origen del MSC a partir de la célula madre hematopoyética. De hecho, con la explantación de una suspensión de células de médula ósea en cultivos de monocapa, crecen en ellas discretas colonias de fibroblastos. Sin embargo, se ha demostrado que la presencia de precursores de colonias de fibroblastos y diversos gérmenes diferenciación de tejido hematopoyético como parte de la médula ósea no es una prueba de su origen común de las células madre hematopoyéticas. El uso de análisis discriminante de las células madre de médula ósea se encontró que el microambiente en el trasplante heterotópico, las células hematopoyéticas de la médula ósea se transfiere, lo que demuestra la existencia, en la médula ósea independiente de la población MSC histogenética de las células hematopoyéticas.

Además, el método de clonación selectiva revela en cultivos monocapa de células estromales de médula ósea de una nueva categoría de células precursoras para determinar sus números, para estudiar sus propiedades, potencial proliferativo y la diferenciación. Se encontró que las células del estroma similares a fibroblastos in vitro proliferan y forman colonias diploides que cuando el trasplante inversa en el cuerpo asegurando la formación de nuevos órganos que forman la sangre. Los resultados de los estudios de clones individuales indican que existe una población de células en su proliferativa y la diferenciación potencial que pueden aspirar el papel de las células madre del tejido del estroma, Gistogeneticheskaja independiente de las células madre hematopoyéticas en las células del estroma progenitoras. Las células de esta población se caracterizan por un crecimiento autoportante y se diferencian en células progenitoras de hueso, cartílago y tejido reticular de médula ósea.

De gran interés son los resultados de los estudios Chailakhyan R. Et al (1997 a 2001), que eran de hueso cultivado del estroma progenitoras células conejos derivadas de médula, conejillos de indias, y ratones de a-MEM medio de cultivo suplementado con suero de ternera fetal. Los autores llevaron a cabo la explantación con una densidad inicial de 2-4 x 103 células de médula ósea por 1 cm2. Como alimentador, se usaron células de médula ósea inactivadas por radiación homólogas o heterólogas en una dosis que retenía la acción de alimentación pero bloqueaba completamente su proliferación. Colonias discretas primarias de dos semanas de fibroblastos fueron tripsinizadas para producir cepas monoclonales. Evidencia colonias origen clonal se obtuvieron utilizando marcadores cromosómicos en cultivos mixtos de médula ósea de cobayas macho y hembra, cultivos vivos de disparo de lapso de tiempo, así como en cultivos mixtos de médula ósea de ratones singénicos y CBA SVAT6T6. Suspensión de trasplante de células de médula ósea recién aisladas cultivadas en fibroblastos in vitro o estromales bajo la cápsula renal se llevó a cabo en ivalonovyh andamios porosos o gelatina, así como matriz de hueso esponjoso conejo inactivado. Clones transplante en la cubierta de hueso de cerdo muslos guinea limpiado de tejido blando y el periostio, cortan la epífisis y el lavado a fondo su médula ósea. El hueso se cortó en fragmentos (3-5 mm), se secó e irradió a una dosis de 60 Gy. En las cubiertas óseas, se colocaron colonias de fibroblastos individuales y se implantaron por vía intramuscular. Para el trasplante intraperitoneal de los fibroblastos del estroma, que se cultiva in vitro, se utilizó tipos una cámara de difusión (V = 0015 cm 3, h = 0, l mm) y D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

Cuando se estudia la dinámica de crecimiento de cepas clonales Chailakhyan R. Et al (2001) encontraron que las células individuales, formadoras de colonias de fibroblastos, así como sus descendientes tienen un gran potencial proliferativo. En el décimo pasaje, el número de fibroblastos en algunas cepas fue de 1.2-7.2 x 10 9 células. En el proceso de su desarrollo, realizaron hasta 31-34 duplicaciones de células. Trasplante heterotópico lo tanto de las cepas derivadas de médula ósea formados por los precursores del estroma varias docenas de clones dieron lugar a la transferencia de microambiente de la médula ósea y la educación en la nueva zona de trasplante de órganos hematopoyético. Los autores plantearon la cuestión de si los clones individuales pueden tolerar células de la médula ósea microambiente del estroma, o se requiere la cooperación de varios diferentes progenitoras estromales clonigénicas? Y si los clones individuales son capaces de transferir el microambiente, ¿será completo para los tres gérmenes, o los diferentes clones proporcionan un microambiente para diferentes brotes hematopoyéticos? Para abordar estos problemas se ha desarrollado la tecnología de las células progenitoras estromales de cultivo en el gel de colágeno que le permite tomar imágenes de la superficie de los fibroblastos colonias para su posterior trasplante heterotópico cultivadas. Los clones individuales fibroblastos del estroma, células de médula ósea obtenidas de ratones CBA y conejillos de indias, cortados junto con un fragmento de la capa de gel y heterotópico trasplantado - bajo la cápsula renal de ratones singénicos o cobayas vientre del músculo autólogas. Cuando se realizó el trasplante en el músculo, las colonias en el gel se colocaron en las cubiertas óseas.

Hemos encontrado que por 50-90 días después del trasplante de médula ósea colonia de fibroblastos en 20% de los casos fueron observados en el desarrollo de la zona del trasplante de hueso o de hueso y el tejido hematopoyético. En el 5% de los animales receptores bolsillos de hueso que tienen una cavidad llena de médula ósea formada. Dentro de los cilindros de hueso esos focos tienen una forma redondeada y una cápsula construida de tejido óseo, con osteocitos y la capa osteoblástica bien desarrollado. Cavidad de la médula ósea contiene tejido reticular con células mieloides y eritroides, las proporciones de que no difieren de la de la médula ósea normal. El injerto renal era un cuerpo medular típico formado por trasplante de médula ósea natal, donde cápsula hueso sólo cubre la cavidad medular de la cápsula renal. Tejido hematopoyético incluido mieloide, megacariocítica y elementos eritroides. Stroma del canal medular se senos bien desarrollada y contenía el sistema de células de la grasa típica. Al mismo tiempo en el área de trasplante de algunas colonias hueso sin signos de la hematopoyesis se encontró bajo la cápsula renal. Estudio de la potencia de proliferación y diferenciación de los clones individuales se continúa en las cepas de la médula ósea de conejo monoclonales, las células se resuspendieron en medio de cultivo y en una esponja ivalonovoy separada de pesaje 1-2 mg escondido bajo la cápsula renal del donante de médula ósea de conejo. Tal autotrasplante se sometió a las células de 21 cepas monoclonales. Los resultados fueron tomados en cuenta en 2-3 meses. Los autores encontraron que el 14% de las cepas monoclonales de médula ósea trasplantadas cuerpo formado compone de cavidad del hueso y la médula ósea lleno de células hematopoyéticas. En 33% de los casos cepas trasplantadas forman hueso compacto con cavidades de diferente tamaño ostootsitami BRICKED en osteoblástica y la capa desarrollada. En algunos casos, esponjas trasplantados clones desarrollados retículo sin hueso o células hematopoyéticas. A veces la formación de estroma reticular se produjo con una red bien desarrollada de sinusoides, pero no rellena las células hematopoyéticas. Por lo tanto, los resultados obtenidos fueron similares a los obtenidos por el trasplante de clones en gel de colágeno. Sin embargo, si el trasplante de clones cultiva sobre el sustrato dado como resultado la formación de tejido de médula ósea es del 5% del hueso - 15% y la tela reticular - en 80% de los casos, el monoclonal trasplante cepas de formación de células de médula ósea se observó en el 14% de los casos de hueso - en 53% y reticular - en 53% de los casos. Según los autores, esto indica que las condiciones para la aplicación de los potenciales proliferativos y de diferenciación de los fibroblastos del estroma cuando se trasplantan en andamios porosos fueron más óptima que con sus trasplantes en hueso y cubre el sustrato colágeno. No se excluye que el uso de métodos más avanzados de cultivo y trasplante de retroalimentación clones puede mejorar las condiciones para la aplicación de sus clones potenciales de diferenciación y cambiar estas relaciones. De una forma u otra, pero el valor principal de la investigación se encuentra en el hecho de que algunos de los clones de las células del estroma capaces de formar tejido óseo garantizando al mismo tiempo microambiente hematopoyético estroma inmediatamente por tres brotes de sangre de la médula ósea: eritroide, mieloide y megacariocítica, creando una lo suficientemente grande como puntos de apoyo tejido hematopoyético y algo de masa ósea

Además, los autores resolvieron el problema de la capacidad para estos tipos de diferenciación celular de células progenitoras estromales clonales individuales en condiciones de un sistema cerrado de cámaras de difusión. Además, era necesario determinar si los clones individuales de exhibición pluripotentes o visualización para el potencial de diferenciación requiere la interacción cooperativa de varios clones con un citodiferenciación signo fijo, proporción diferente de los cuales determina la formación preferencial de hueso, cartílago o reticular. Mediante la combinación de dos enfoques metodológicos - monoclonal aísla las células progenitoras estromales de médula ósea y el trasplante de ellos en las cámaras de difusión, Chailakhyan R. Et al (2001) obtuvieron resultados que permitieron a acercarse a la comprensión de la organización estructural de la estroma de la médula ósea. Trasplante de cepas monoclonales células progenitoras estromales en células de tipo O dio lugar a la formación tanto de tejido óseo y el cartílago, que demuestra la capacidad de la descendencia de uno células estromales formadoras de colonias que forman simultáneamente hueso y cartílago. La suposición de que el tejido óseo y cartilaginoso se origina a partir de la célula progenitora estromal común ha sido repetidamente expresada repetidamente. Sin embargo, esta hipótesis no tenía una confirmación experimental correcta. La formación de hueso y cartílago en cámaras de difusión fue una prueba necesaria de la existencia entre las células madre del estroma de médula ósea de una célula precursora común para estos dos tipos de tejido.

Luego, se colocaron 29 cepas clonales del segundo y tercer pasaje obtenidas de los cultivos primarios de la médula de conejo en cámaras de difusión y se implantaron intraperitonealmente con animales homólogos. Los estudios han demostrado que el 45% de las cepas monoclonales de médula ósea tienen potencias osteogénicas. Excepcionalmente, el tejido reticular contenía 9 cámaras, pero junto con el hueso y el tejido cartilaginoso estaba presente en 13 cámaras más, que representaban el 76% de todas las cepas. En cámaras de tipo O, donde fue posible la diferenciación tanto del tejido óseo como cartilaginoso, se estudiaron 16 cepas. En cuatro cámaras (25%), se formaron tejido óseo y cartilaginoso. De nuevo hay que señalar que los estudios Chailakhyan R. Et al (2001) las células progenitoras individuales fueron sometidos cepa de células que consiste en de 31 a 34 duplicaciones, y su progenie fue 0,9-2,0 × 10 9 células. El número de mitosis a las que se expusieron las células precursoras de las cepas policlonales fue prácticamente el mismo que el de las células de las cepas monoclonales. Al mismo tiempo, la tasa de desarrollo de cepas policlonales, especialmente en la primera fase de su formación, dependió en gran medida del número de colonias utilizadas para el inicio de las cepas. Las cepas diploides de fibroblastos embrionarios humanos (WI-38) cuando se formaron de nuevo a 12-15 niveles de duplicación también formaron colonias que diferían en diámetro y en el contenido de células en ellas. Las colonias grandes que contienen más de 103 células eran solo del 5-10%. Con el aumento en el número de divisiones, el porcentaje de colonias grandes disminuyó. Las cepas de fibroblastos estromales de médula ósea de mono y policlonales retienen un cromosoma diploide establecido después de 20 o más duplicaciones, y la tendencia de desarrollo fue comparable a la dinámica de cepas diploides fibroblastos embrionarios. El análisis del potencial de diferenciación de células progenitoras del estroma de médula ósea individuales, llevadas a cabo mediante el trasplante de cepas monoclonales en cámaras de difusión, mostró que la mitad de ellas son osteogénicas. Las grandes colonias representaron el 10% de su número total. En consecuencia, el número de células formadoras de colonias osteogénicas correspondió aproximadamente al 5% de su población total. En la masa total de células progenitoras osteogénicas identificadas por los autores, había células capaces de formar tejido óseo y cartilaginoso simultáneamente. Por primera vez se encontró que para estos dos tipos de tejidos en el organismo adulto es la célula precursora común: 25% de los clones ensayados fueron creados por células similares, y sus números en la población general de células progenitoras no era inferior a 2,5%.

Por lo tanto, el trasplante heterotópico de clones individuales de fibroblastos de médula ósea ha abierto nuevos aspectos de la organización estructural de la población de células progenitoras mesenquimales. Las células estromales progenitoras encontrados capaces de transferir microambiente específico de inmediato para todos tallo hematopoyético que número de entre los clones investigados más grandes en diferentes modelos es de 5 a 15% (0,5-1,5% del número total de células progenitoras detectado). Junto con los clones, la transferencia completa microambiente de la médula ósea, hay células progenitoras, deterministas sólo para la formación de hueso, que forma cuando se transfiere a un sistema abierto, el hueso que no soporta el desarrollo de la hematopoyesis. Su número del número total de células progenitoras es 1.5-3%. Algunas de estas células pueden formar tejido óseo con un período limitado de auto-mantenimiento. En consecuencia, la población de células progenitoras estromales es heterogénea en su potencial de diferenciación. Entre ellos hay una categoría de células, afirmando que el papel de las células madre del estroma capaces de diferenciarse en las tres dimensiones inherentes en el tejido de la médula ósea del estroma, formando hueso, cartílago y tejido reticular. Estos datos nos permiten confiar en que con la ayuda de varios marcadores de células será posible determinar la contribución de cada tipo de células del estroma en el microambiente de la organización específica y apoyar la hematopoyesis en cultivos Dexter.

Características de las células madre mesenquimales

En los últimos años, se encontró que en cultivos estacionarios de médula ósea células progenitoras multipotentes mesenquimales presentan una población limitada de pequeñas células agranulares células (RS-1), caracterizado por una baja capacidad de colonización y la ausencia de Ki-67 expresión del antígeno específico para células proliferantes. Los parámetros antigénicos de las células durmientes RS-1 difieren del espectro antigénico de las células progenitoras estromales comprometidas que proliferan rápidamente. Se encontró que se observó una alta tasa de proliferación de células progenitoras comprometidas solo en presencia de células RS-1. A su vez, las células RS-1 aumentan la tasa de crecimiento bajo la influencia de factores secretados por los derivados más maduros de las células progenitoras mesenquimales multipotentes. Parece que las células RS-1 son una subclase de MSCs no comprometidas que son capaces de reciclarse. En resistentes a 5-fluorouracilo células del estroma progenitoras de la médula ósea que se caracteriza por un contenido de ARN bajo y altos niveles de expresión del gen de la ornitina descarboxilasa vitro - marcador de células no proliferantes.

La reproducción intensiva de las células progenitoras del estroma comienza después de la fijación en el sustrato. Cuando este perfil se expresa marcador de células poco diferenciadas: SH2 (TGF-receptor (3), SH3 (proteína de señalización de dominio), colágeno tipo I y III, fibronectina, VCAM-1 receptor de adhesión (CD106) y ICAM (CD54), cadherina-11 , CD44, CD71 (receptor de transferrina), CD90, CD120a y CD124, pero sin la expresión de marcadores característicos de células madre hematopoyéticas (CD34, CD14, CD45). El crecimiento clonal permite repetidamente a pases las células madre mesenquimatosas para producir un cultivo de muchos genéticamente homogéneo pluripotentes estromal progenitor células. 2-3 el paso de su número llega a 50-300 millones. En la cultura de densidad suficiente después de detener la proliferación de las células del estroma progenitoras, a diferencia de los fibroblastos de tejidos hematopoyéticos se diferencian en adipocitos, miocitos, células de cartílago y tejido óseo. La combinación de las señales reguladoras tres de diferenciación que comprende 1-metil-izobutilksantin (inductor de la formación de AMPc intracelular), dexametasona (un inhibidor de la fosfolipasa a y C) y la indometacina (un inhibidor de la ciclooxigenasa, actividad de disminución de tromboxano y) se convierte en adipocitos hasta el 95% de las células mesenquimales progenitoras. Formación de adipocitos a partir de células del estroma inmaduros confirmó la expresión del gen de la lipoproteína lipasa, la identificación histoquímica de apolipoproteínas y receptores peroxisómicos. Las células del mismo clon influenciado por TGF-b en medio libre de suero crea una población homogénea de los condrocitos. El cultivo celular multi-capa de cartílago de la matriz extracelular se caracteriza desarrollado que consiste de proteoglicanos y colágeno de tipo II. El medio nutriente con complejo de 10% de suero fetal señales de efecto de diferenciación que consta de b-glicerofosfato (donador de fosfato inorgánico), ácido ascórbico y dexametasona, en las mismas células progenitoras progenitoras estromales de cultivo conduce a la formación de agregados de células. En tales células, hay un aumento progresivo de la actividad de los niveles de fosfatasa y osteopontina alcalinas, lo que indica la formación de la mineralización ósea que las células confirmaron un aumento progresivo en el calcio intracelular.

Según algunos, la capacidad de las células madre mesenquimales a dividirse indefinidamente y la reproducción de diversos tipos de células del linaje mesenquimales combinados con un alto grado de plasticidad. Cuando se administra en los ventrículos, o células madre mesenquimales materia blanca migrar en el parénquima del tejido nervioso y diferenciar en la línea celular neuronal o glial derivada. Además, no hay información acerca de MSC transdiferenciación en células madre hematopoyéticas tanto in vitro, como in vivo. Un análisis más en profundidad en algunos estudios determinados excepcionalmente alta ductilidad de las MSC, que se manifiesta en su capacidad de diferenciarse en astrocitos, oligodendrocitos, neuronas, cardiomiocitos, células musculares lisas y células del músculo esquelético. En una serie de estudios transdifferentsirovochnogo potencial de las MSC in vitro e in vivo encontrado que las células precursoras mesenquimatosas multipotentes de origen de la médula ósea se diferencian terminalmente en líneas celulares que forman hueso, cartílago, músculo, nervio y el tejido adiposo, así como los tendones y el estroma que soporta la hematopoyesis .

Sin embargo, en otros estudios, no hay signos de restricción genoma pluripotencia de las células madre mesenquimales y podrían no ser detectados poblaciones de células del estroma progenitor, pero para comprobar posibles células estromales pluripotentes se investigó más de 200 clones de MSC aisladas de un cultivo primario. La gran mayoría de clones in vitro retuvo la capacidad de diferenciarse en osteogénico, condrogénica y direcciones adipogénicos. Al excluir la probabilidad de migración de las células receptoras por el trasplante de células madre mesenquimales bajo la cápsula renal o en cámaras de difusión que parecía que las células estromales progenitoras in situ conservan fenotipo heterogéneo, que indica o bien la ausencia de un trasplante zona factores de restricción o la ausencia de MSCs pluripotentes solo. Al mismo tiempo permitido la existencia de un raro tipo de células madre pluripotentes somáticos, que son precursores comunes de células madre adultas.

En las células madre mesenquimales pluripotentes múltiples, pero no es cierto constituyen una fracción muy pequeña de células de médula ósea y son capaces, en ciertas circunstancias, cuando se cultivan in vitro para proliferar sin entrar en la diferenciación, como lo demuestra su compromiso de linaje inducida de células en el hueso, cartílago, grasa, el tejido muscular , así como en los tenocitos y elementos estromales que soportan la hematopoyesis. Típicamente, la exposición continua en medio de cultivo con suero de ternera fetal provoca MSCs de salida en estroma de las células progenitoras comprometidas, la progenie de los cuales se somete a diferenciación final espontánea. In vitro posible lograr la formación de osteoblastos direccional añadiendo al ácido acondicionado dexametasona medio, ß-glicerofosfato y ascórbico, mientras que la combinación de la diferenciación de las señales de dexametasona y la insulina induce la formación de adipocitos.

Establecido que antes de entrar en la etapa de la diferenciación terminal de las MSC de médula ósea para crear ciertas condiciones de cultivo inicialmente se diferencian en células madre mesenquimales similares a fibroblastos. Los derivados de estas células in vivo están involucrados en la formación de hueso, cartílago, tendón, grasa y tejido muscular, así como soporte de estroma hematopoyesis. Muchos autores entienden el término "células progenitoras multipotentes mesenquimales", como en realidad MSCs, y las células del estroma progenitoras comprometidas y tejidos mesenquimales de médula ósea. Análisis clonal de células progenitoras multipotentes mesenquimales de origen de la médula ósea mostró que poco más de un tercio de los clones diferenciados en osteo-, hondro- y adipocitos, mientras que las células de otros clones tienen osteogénico potencial y una forma única hondro- y osteocitos. Este clon de células precursoras mesenquimatosas multipotentes como DIU-9, en condiciones apropiadas microambiente diferenciadas en células con un fenotipo y funcionales características no sólo de osteoblastos, condrocitos y potsitov adic pero las células del estroma que soportan la hematopoyesis. Aislado de células de médula ósea de rata fetales clonar RCJ3.1 diferenciado células mesenquimales de diferentes fenotipos. Por la acción combinada de ácido ascórbico, b-glicerofosfato, y dexametasona a partir de elementos celulares de este clon se forma primero miocitos multinucleadas y luego, sucesivamente, adipocitos, condrocitos e islotes de hueso mineralizado. La población de células granulares del periostio de fetos de rata corresponde a las células progenitoras mesenquimatosas multipotentes no comprometidos, tal como se caracteriza por un bajo índice de proliferación, no expresa marcadores de diferenciación, y diferenciada en las condiciones de cultivo para formar hondro-, osteo- y adipocitos y células del músculo liso.

Por lo tanto, se debe reconocer que la cuestión de genoma plyuri- o multipotencia de células madre mesenquimales está todavía abierta, que afecta por consiguiente, la presentación del potencial de diferenciación de las células progenitoras estromales, que es también no completamente instalado.

La característica experimentalmente probada e importante de las células madre mesenquimales es su capacidad para abandonar el nicho de tejido y circular en el torrente sanguíneo general. Para activar el programa genético de diferenciación, tales células madre circulantes deberían caer en el microambiente apropiado. Se muestra que cuando se administra sistémicamente al torrente sanguíneo animales receptores MSCs células implantadas en diferentes órganos y tejidos inmaduros, entonces diferenciarse en sangre células, miocitos, adipocitos, condrocitos, y fibroblastos. Por consiguiente, en las zonas de tejido local, existe una interacción reguladora de señal entre las células progenitoras estromales no acreditadas y comprometidas, y también entre ellas y las células maduras circundantes. Se supone que la inducción de la diferenciación se lleva a factores paracrinos reguladoras de origen mesenquimal y nemezenhimalnogo (factores de crecimiento, los eicosanoides, moléculas de la matriz extracelular) que proporcionan las relaciones espaciales y temporales en el microambiente de progenitores mesenquimales multipotenciales. Por lo tanto, el daño local del tejido mesenquimal debe conducir a la formación de una zonas microambiente células precursoras mesenquimatosas multipotentes difieren cualitativamente de las señales reguladoras complejas tejidos intactos en el que los procesos fisiológicos se producen en lugar de la regeneración reparadora. Esta diferencia es extremadamente importante en términos de la especialización del fenotipo celular en un microambiente normal e inducido por daño.

De acuerdo con las ideas, es aquí donde se establecen los mecanismos de la diferencia fundamental de dos procesos conocidos: la regeneración fisiológica y la proliferación inflamatoria. El primero de ellos finaliza con la restauración de la composición del tejido celular especializado y su función, mientras que el resultado del proceso de proliferación es la formación de elementos maduros del tejido conectivo y la pérdida de función de la zona del tejido dañado. Por lo tanto, para el desarrollo de programas óptimos para el uso de células progenitoras mesenquimatosas multipotentes en medicina regenerativa-plástica, es necesario un estudio cuidadoso de las características de la influencia de los factores del microambiente en la diferenciación de las MSC.

La dependencia de la estructura del compartimento de las células madre sobre los reguladores paracríticos y autocrinos celulares, cuya expresión está modulada por señales externas, nadie duda. Entre las funciones de los factores reguladores, los más importantes son el control de la división asimétrica de MSC y la expresión de genes que determinan las etapas de comisión y el número de divisiones celulares. Las señales externas, de las cuales depende el desarrollo adicional de MSC, son proporcionadas por su microambiente. En MSCs inmaduras a proliferar tiempo suficientemente largo, mientras se mantiene la capacidad de diferenciarse en línea de adipocitos, miofibroblastos, tejido estromal hematógena, células de cartílago y hueso. Se ha encontrado que una población limitada de circulación elementos de célula estromal SB34-negativas de la circulación general se devuelve al tejido estroma de médula ósea, se transforma en una línea donde las células madre hematopoyéticas CD34-positivas. Estas observaciones sugieren que las células mesenquimales de recirculación progenitoras en el torrente sanguíneo de tejido proporciona soporte para el equilibrio de las células madre del estroma en diferentes órganos mediante la movilización de fondo común de células estromales de médula ósea inmaduras. La diferenciación de las MSC en células con múltiples fenotipos mesenquimales y su participación en la reparación o regeneración de hueso, cartílago, tendón y el tejido adiposo in vivo demostrado por los modelos de transferencia adoptiva en animales de experimentación. De acuerdo con otros autores, la migración distante de la cama vascular MSCs se combina con un desplazamiento local o células precursoras mesenquimatosas multipotentes korotkodistantnym dentro del tejido en el cartílago de reparación, la regeneración muscular, y otras reacciones de reducción.

Las reservas locales se derivan del estroma de tejido fundaciones desempeñan un papel de fuente de células en unos procesos fisiológicos de regeneración de tejidos y se reponen por las MSC de transporte distantes como el gasto del estroma recursos madre de tejido. Sin embargo, en necesidad de movilización de emergencia de la capacidad reparadora celular, tal como trauma múltiple, en los procesos de reparación de la regeneración participa toda MSCs tren, y la periferia a través del torrente sanguíneo reclutó células precursoras mesenquimales de la médula ósea.

Trasplante de células madre mesenquimales

Existen ciertos paralelos entre los procesos de regeneración fisiológica de los tejidos y su formación durante el período de desarrollo intrauterino. La embriogénesis de seres humanos y mamíferos, la formación de diversos tipos de células especializadas derivadas de ecto, meso y endodérmico germen capas piscina, pero con la participación obligatoria del mesénquima. La red celular suelta de tejido mesenquimal embrionario realiza numerosas funciones reguladoras, metabólicas, esqueléticas y morfogenéticas. Cuerpos provisorios marcador se llevaron a cabo sólo después de la mesénquima de condensación a expensas de crecimiento clonogénico de células progenitoras que generan primaria señales morfogenéticas organogénesis. Los derivados estromales del mesénquima embrionario crean un marco celular de órganos provisionales y forman la base para su suministro de energía en el futuro mediante el crecimiento de vasos sanguíneos y linfáticos primarios. En otras palabras, los elementos del estroma de la unidad microcirculatoria de los órganos fetales aparecen antes de la formación de sus unidades estructural-funcionales. Además, la migración activa de células mesenquimáticas durante la organogénesis proporciona una orientación espacial de los órganos en desarrollo debido a la marcación de sus límites de volumen mediante la restricción de Noch-Teps homeóticos. En el andamiaje estromal también hay un conjunto de unidades estructurales y funcionales de órganos parenquimatosos, que a menudo contienen células morfogenéticas y funcionalmente completamente diferentes. En consecuencia, en la embriogénesis, las funciones mesenquimales son primarias y se realizan mediante la generación de señales reguladoras que activan la proliferación regional y la diferenciación de las células epiteliales progenitoras. Las células de mesénquima embrionario producen factores de crecimiento tales como LEG, HGF-b, CSF, para los cuales las células progenitoras parenquimáticas tienen los receptores correspondientes. En el tejido maduro diferenciado de un organismo adulto, la red de células estromales también genera señales para mantener la viabilidad y la proliferación de células progenitoras de origen no mesenquimal. Sin embargo, las señales reguladoras del estroma espectro en postnatal ontogénesis otro (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, etc.) y está destinado a proporcionar regeneración fisiológica o reparación de zonas de tejido dañadas. Además, las características espectrales de los factores reguladores del estroma en cada tipo de tejido e incluso dentro del mismo órgano son diferentes. En particular, la hematopoyesis y la linfopoyesis a la multiplicación y la diferenciación de células hematopoyéticas y inmunocompetentes se produce sólo en ciertos órganos, dentro de la cual actúa microambiente estromal proporcionando condiciones para la maduración de las células hematopoyéticas y linfoides. Corresponde a factores reguladores microambiente depende de la capacidad de las células hematopoyéticas y linfoides para repoblar el cuerpo para proliferar y madurar en sus nichos microestructurales.

Entre los componentes de la matriz extracelular, que producen las células precursoras mesenquimatosas multipotentes, cabe señalar fibronectina, laminina, colágeno y proteoglicanos, así como CD44 (hialuronano y receptor osteopontina) que recibe la parte principal en la organización de la interacción intercelular y la formación de matriz extracelular en la médula ósea y el hueso . Está comprobado que mesenquimales de la médula ósea, las células multipotentes crear microambiente estromal redshestvenniki, proporcionando las señales inductivas y de regulación no sólo el MSC, pero también precursores hematopoyéticos y células madre de médula ósea nemezenhimalnye. Se sabe que las MSC que participan en la hematopoyesis se mide por su capacidad de diferenciarse en células del estroma que soportan la hematopoyesis, en el que la señal de MSK orientación activa obtenida directamente a partir de células madre hematopoyéticas. Es por ello que el cultivo de células progenitoras estromales de la red es la base de la alimentación de todos los clones de células hematopoyéticas.

En una intensidad organismo maduro de la hemodiálisis y la linfopoyesis en un estado de equilibrio dinámico con el "gasto" de las células sanguíneas maduras y células del sistema inmune en la periferia. Dado que las células estromales de la médula ósea y órganos linfoides rara vez se actualizan, estructuras significativas del estroma reestructuración no se produce en ellos. Llevar el sistema de equilibrio dinámico es posible con la ayuda de un daño mecánico en cualquier órgano hemo o linfopoiesis, lo que conduce a un mismo tipo de cambios secuenciales que afectan no sólo y no tanto de las células hematopoyéticas o linfoides, como las estructuras del estroma dañados de órganos. En el proceso de regeneración marco del estroma formado principalmente reparadora, que luego repoblación hematopoyéticas o células inmunes. Este hecho conocido largo hace que la regeneración postraumático modelo conveniente para estudiar el microambiente del estroma de los órganos que forman la sangre. En particular, para la investigación de la regeneración reparadora de la médula ósea se usa mecánica vaciado cavidad medular de los huesos largos - legrado, lo que permite llevar rápidamente y con eficacia el tejido hematopoyético de un estado de equilibrio dinámico. Cuando se estudia el proceso de regeneración reparadora de los componentes hematopoyéticas y el hueso del estroma de médula después de vaciamiento mecánico de la cavidad medular de los conejillos de indias de tibia encontrado que entre los indicadores de regeneración de las células hematopoyéticas y del estroma (el número de células hematopoyéticas, la concentración y la cantidad de las células del estroma progenitoras) no existe una correlación directa. Además, se encontró que el aumento de la población de células progenitoras estromales se produce en una fecha anterior después de legrado, y los propios fibroblastos del estroma son fosfatazopolozhitelnymi, que es característica de tejido osteogénico. También se estableció que los legrado 3-5 huesos largos conduce al crecimiento de la población de células en la médula ósea y el hueso no operado incluso en el bazo, que en cobayas es único cuerpo linfopoyético.

Morfológicas procesos imagen reparativos en la médula ósea kyuretirovannyh tibiales cobayas generalmente corresponde a datos de la literatura obtenidos en los experimentos en animales de otras especies, la dinámica de cambios que tienen lugar después de la eliminación del tejido hematopoyético es la misma para todas las especies y la diferencia sólo se refiere a los parámetros de tiempo . Morfológicamente procedimiento de fase para la restauración de la hematopoyesis en la cavidad medular se vacía en los procesos sucesivos organización de la formación de coágulos de sangre hueso fibra gruesa, su resorción, de sinusoides y estroma formación reticular, que repoblación además elementos hematopoyéticos. El número de células progenitoras hematopoyéticas en la médula ósea de proceso de regeneración tisular aumentos en aumento paralelo en el contenido de células madre hematopoyéticas.

Gerasimov Yu et al (2001) compararon los cambios en el número de células hematopoyéticas y la cantidad de precursores de células del estroma en las fases individuales del proceso de regeneración. Se encontró que los cambios cuantitativos en células de médula ósea en kyuretirovannoy hueso partidos dinámica de características de regeneración morfológicas. Reducción durante los tres primeros días de contenido de la celda en autores regenerados atributo la pérdida de células hematopoyéticas debido a los efectos adversos del microambiente, lo que crea tejido reticular crece en la médula ósea restante en la epífisis y en este último para formar osteoide focos y el daño vascular con legrado. 7-12 día elevar células yaderosoderzhaschih th coincide con la aparición de los focos individual en las células del estroma zonas de proliferación hematopoyéticas mieloides. En el vigésimo día hay porciones significativas de la médula ósea regenerada y los senos bien desarrollados, que se acompaña de un aumento significativo en el número de células total. Sin embargo, el número de elementos hematopoyéticos en este período es del 68% del nivel de control. Esto es consistente con los datos previamente publicados que muestran que el número de células formadoras de sangre después de legrado alcanza estándares de sólo 35-40 días después de la operación.

En el período post-traumático temprano, la principal fuente celular para la restauración de la hemopoyesis son los elementos celulares preservados en el curetaje. En términos posteriores, la principal fuente de regeneración del tejido hematopoyético de la médula ósea son las células madre, repoblando las zonas estromales libres. En cuanto a ciertas categorías de células estromales (endoteliales, reticulares y osteogénicas), las fuentes que proporcionan su formación durante la reconstrucción de la cavidad medular permanecen sin explicación. Los resultados de Yu.V. Gerasimov y sus coautores (2001) testifican que en la médula ósea preservada después del curetaje, la concentración de células que forman colonias de fibroblastos es significativamente más alta que en la médula ósea normal. Los autores creen que con legrado es más intenso elución selectiva de las células hematopoyéticas en comparación con las células que están implicadas en la formación de estroma y más firmemente conectados con su sustancia básica que las células hematopoyéticas formadoras de colonias estromal.

La dinámica de los cambios en el número de células formadoras de colonias de fibroblastos se correlaciona con la intensidad de los procesos de osteogénesis posterior trabecular resorción ósea y la formación reticular estroma que pueblan células hematopoyéticas. La mayoría de las células progenitoras del estroma forman un tejido óseo fibroso grueso y un estroma reticular en los tiempos de regeneración indicados. Para las fracturas de hueso femoral en condiciones de osteosíntesis prolongada sobre el quinto día en la zona de regeneración aumenta la concentración de células y el número de fibroblastos formadoras de colonias, y la formación de hueso en intensiva su número se incrementa en 6 veces. Se sabe que las células de médula ósea que forman colonias de fibroblastos poseen propiedades osteogénicas. El número de células progenitoras del estroma aumenta antes de la colonización del área de la médula ósea cortexed por las células hematopoyéticas. Esto está de acuerdo con la evidencia de que las células estromales proporcionan la formación de un microambiente hematopoyético. Obviamente, la creación de microambiente hematopoyético corresponde a un cierto nivel de regeneración de tejido estromal, y aumenta el número de células hematopoyéticas sobre estroma expansión cabeza de puente adecuado para la hematopoyesis.

De mayor interés son los datos de los autores que inmediatamente después del curetaje aumenta el número de células progenitoras del estroma en las partes remotas del esqueleto. Desde la sexta hora hasta el vigésimo día inclusive, en la tibia contralateral hay un aumento de más del doble en la concentración y el número de células que forman la colonia de fibroblastos. El mecanismo de este fenómeno es, probablemente, conectado con el hecho de que una lesión masiva de médula ósea que resulta en la formación de un gran número de los coágulos de sangre mientras que la destrucción simultáneamente un número significativo de las plaquetas y la liberación en el factor de crecimiento derivado de las plaquetas de la sangre (RBSK), que se sabe que causa la proliferación de células formadoras de colonias fibroblastos ubicados en el cuerpo fuera del grupo proliferativo. En experimentos con conejos administración local MSCs promueve la restauración del cartílago dañado quirúrgicamente de la rodilla, que puede estar asociada con la formación de condrocitos derivados de MSCs introducidas. Sin embargo, la regeneración reparadora de los defectos óseos en ratas de laboratorio se ve enormemente potenciada por el uso de células madre mesenquimales encapsuladas en un marco cerámico. Por lo tanto, podemos suponer que si no RBOK, a continuación, cualquier otro factor, derivado de las células estromales dañadas, tiene un efecto estimulante distante sobre la proliferación de células progenitoras mesenquimales en zonas intactas de la médula ósea y estimula su migración a la zona del tejido de la médula ósea del defecto. A su vez, esto contrario a datos de la literatura de los años anteriores, lo que indica que las células estromales son responsables del microambiente, a diferencia de las células hematopoyéticas no son capaces de migrar y provienen de fuentes locales.

Sin embargo, los resultados del estudio Gerasimov Yu et al (2001) sugieren que la aplicación de trauma mecánico provoca no sólo una fuerte reestructuración del tejido estromal en los huesos kyuretirovannoy, sino también cambios significativos en los huesos remotas estroma intacto, es decir, hay una respuesta sistémica tejido estromal para trauma local. Y cuando se aplica politraumatismo - curetaje múltiple - esta reacción se amplifica y se observó no sólo en el hueso operado y partes distantes del esqueleto, pero también en los órganos linfoides, en particular el bazo. Se desconoce el mecanismo de dicha respuesta sistémica del tejido estromal de la médula ósea y del bazo a los traumatismos locales y al politraumatismo. Se supone que este proceso está asociado con el efecto del factor humoral liberado por el estroma mesenquimal de la cavidad medular de la médula ósea. Posibilidad de hacer que las células estromales de la médula ósea y el bazo organonespetsificheskogo factor humoral responsable de la proliferación celular, formadoras de colonias de fibroblastos indican datos sobre su estimulante de colonias de actividad en cultivos monocapa de médula ósea.

A este respecto, es de destacar que cuando se administra células precursoras mesenquimatosas multipotentes sistémicamente repoblación sus derivados no sólo de la médula ósea, pero también otros tejidos, que se utiliza, en particular para la terapia génica. Se muestra que después de la administración intravenosa de grandes cantidades de MSCs con el genoma de los ratones de tipo salvaje con células de colágeno mutante gen I donantes sustituir hasta el 30% de las células en hueso y cartílago tejido del receptor, y las células de ratón madre mesenquimales transfectadas secretan IL-3 humana, durante 9 meses apoyar eficazmente la hematopoyesis en el caso de su administración simultánea con las células madre hematopoyéticas humanas en ratones inmunodeficientes.

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Modificación genética de células madre mesenquimales

éxito experimental adicional de la modificación genética debe observarse MSCs transfección Factor IX gen en MSC humanas seguido de la transferencia de células transfectantes ratones inmunodeficientes, que conduce a la aparición en la sangre factor antihemofílico B de más de 8 semanas después del trasplante. En este experimento, la modificación postraduccional del factor IX con γ-glutamil carboxilasa se realizó en células transfectadas. Transducción de MSCs con un factor humano IX retroviral vector de codificación, ha tenido menos éxito - posterior introducción de estas células con el perro de la hemofilia en un nivel terapéutico de factor IX, que apoya normal de hemostasia intensidad de coagulación, sólo para 12 días.

El trasplante de células madre mesenquimales al parénquima cerebral de animales ha demostrado que las células inmaduras del donante se transforman tanto en la población de neuronas como en la de la glía. El injerto de derivados neuronales del tejido mesenquimal del donante sano teóricamente permite corregir las anomalías genéticas del metabolismo cerebral en pacientes con la enfermedad de Gaucher y otros trastornos del metabolismo lipídico, gangliósidos o carbohidratos.

Continuando experimental condiciones de búsqueda transdiferenciación de células madre en células precursoras estromales de médula ósea en el tejido nervioso y el hígado. La atención de los investigadores se centra en combinaciones de inductores de diferenciación y medios de acondicionamiento especiales. En particular, para aislar el cultivo primario con suero de ternera fetal al 10%, las células de médula estromales de la médula lavaron y se resuspendieron en medio de cultivo DMEM / F12 (1/1) se siembran a una densidad de 200.000 / cm2. Después de 24 horas, las células no adherentes se retiran y se unen a las células de fibroblastos de plástico se cultivan durante una semana. Para la diferenciación de células estromales de médula ósea a neuroblastos utilizados medio acondicionado obtenido mediante el cultivo de la cultura de tres días de los fibroblastos embrionarios de ratón primario, así como entre DMEM / F12 (1/1) con suero de ternera fetal al 2% y suplementado con 20 ng / ml o 10-6 M LiF ácido retinoico (neuroinductores, que se usan para la diferenciación neural de células madre embrionarias humanas y de ratón). La diferenciación de células estromales de médula ósea en células progenitoras en los hepatocitos se indujo ambiente acondicionado creado como resultado de tres días de cultivo de un cultivo primario de células de hígado de ratón embrionarias en DMEM / F12 (1/1) suplementado con suero de ternera fetal al 10%.

Aquí debe observarse nuevamente que las células formadoras de colonias del estroma de la médula ósea son heteromórficas y se pueden dividir en dos tipos. El primer tipo incluye células similares a fibroblastos que forman células de filopodia con núcleos grandes y uno o dos nucleolos. El segundo tipo está representado por pequeñas celdas de forma fusiforme. En el cultivo de células de ambos tipos en un medio condicionado obtenido en la capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de ratón primario, las células similares a los neuroblastos aparecen en el tercer y cuarto días en cultivo. En esta etapa, a menudo tienen forma de huso con uno o dos procesos largos que terminan con filopodia. Las células piramidales o estrelladas con dendritas cortas son menos comunes. Dendritas uno neuroblastos tienen expansión típico (crecimiento de riñón) y la ramificación en su porción distal, el otro - con un conos de crecimiento distinto filopodios, a través del cual se produce el crecimiento de dendritas. Signos morfológicos similares (riñones y conos de crecimiento con filopodios), inherentes a los neuroblastos, que se diferencian en neuronas, se describen en detalle en trabajos sobre neurogénesis. Sobre esta base, algunos autores concluyen que las células que detectan en cultivo son neuroblastos. En particular, Schegelskaya E. Et al (2002), después de un cultivo primario de células del estroma se cultivaron durante dos semanas en un reemplazable en cada medio condicionado día Z-y-cuarto encontró que parte de las células proliferantes, conservando el estado no diferenciado. Exteriormente, tales células se veían como fibroblastos y se identificaron en cultivo junto con neuroblastos diferenciadores. La mayoría de las células (alrededor del 80%) se encontraban en diferentes etapas de diferenciación en células del tejido nervioso, principalmente en neuronas. Los procesos dendríticos de estas células se contactaban estrechamente entre sí, de modo que gradualmente las células se formaron en las secciones del sustrato de la red nerviosa en forma de hebras multicelulares largas. Los procesos dendríticos de los neuroblastos crecieron mucho más, algunos de ellos 8-10 veces más que la longitud del cuerpo de la neurona. Poco a poco, la proporción de células piramidales y estrelladas aumentó. Dendritas de células estrelladas ramificadas. Según los autores, la diferenciación posterior de las células piramidales y estrelladas en comparación con las de forma fusiforme corresponde a la secuencia de etapas de la neurogénesis normal en animales. Como resultado, los autores concluyen que las células madre del estroma de la médula ósea se someten a neurogénesis inducida, durante la cual, in vitro, a partir de neuroblastos, se forman los tres tipos principales de neuronas. Los predecesores de células nerviosas también se detectaron durante el cultivo de células de estroma de médula ósea durante 3-4 días en medio con 2% de suero fetal y 20 ng / ml de LIF. Pero en este caso las células madre se dividieron muy lentamente, la diferenciación de los neuroblastos se produjo solo en el 30% de los casos y no formaron redes neuronales. Utilizando como ácido retinoico inductores de la diferenciación de las células nerviosas, los autores obtenidos en cultivo para el 25-30% de las células nerviosas con un predominio de células gliales - astrocitos y oligodendrocitos. Las neuronas representaban solo un tercio de todas las células nerviosas, aunque estaban representadas por los tres tipos: células fusiformes, piramidales y estrelladas. En el sexto día de las células estromales de cultivo en las células nerviosas medio ácido retinoico se hizo más diferenciada, mientras que se encontraron los axones individuales de neuronas piramidales que en el neuroontogenesis normales aparecen más tarde formación de los procesos dendríticos. Según los autores, a pesar del bajo rendimiento de las células nerviosas, el método de inducción de ácido retinoico tiene ventajas: astrocitos y oligodendrocitos y myelinating operar las funciones de alimentación durante el crecimiento de los axones y dendritas y son necesarios para la formación normal del tejido nervioso. Por lo tanto, para reparar sus sitios dañados in vivo, es mejor usar una suspensión de neuronas enriquecidas con células gliales.

En la segunda serie de experimentos, los autores intentaron inducir la diferenciación de las células del estroma de la médula ósea en las células hepáticas. Después de un cultivo de tres días de las células madre del estroma de la médula ósea en el medio acondicionado obtenido mediante la incubación de los hepatocitos embrionarios de ratón, se han encontrado células grandes, de forma esférica, a menudo, inclusiones citoplasmáticas de dos nucleares con diferentes tamaños. Estas células se encontraban en diferentes etapas de diferenciación y diferían en tamaño, número de núcleos e inclusiones en el citoplasma. En la mayoría de estas células, se detectó glucógeno, sobre la base del cual los autores los identificaron como células progenitoras de los hepatocitos. Dado que el cultivo se detectaron similares a neuroblastos no hay células, seguido de una conclusión de que en el medio acondicionado obtenido mediante el cultivo de hepatocitos embrionarios, no hay factores de diferenciación de las células nerviosas y, a la inversa, hay factores que inducen la diferenciación de células estromales de médula ósea en células progenitoras de hepatocitos . Los autores sugieren la presencia de células pluripotentes a partir de estroma de médula ósea, medida que se diferencian in vitro en células de tejido hepático o neuronal en función de los medios condicionados específicos, e inductores.

En algunos trabajos, la diferenciación de las células del estroma de la médula ósea en cardiomiocitos, cartílago, hueso y células del tejido nervioso se muestra correctamente. Existe información de que entre las células de la médula ósea hay poblaciones de células madre que pueden diferenciarse en hepatocitos. A la luz de estos resultados anteriores experimentación en ratones todavía puede considerarse como otra confirmación de la presencia en las células madre pluripotentes mesenquimales de la médula ósea que tienen una capacidad de diferenciarse en células de diversos tejidos del organismo adulto.

Trasplante de células madre mesenquimales

En el trasplante clínico de células madre mesenquimatosas humanas pueden usarse para la expansión de células madre hematopoyéticas y sus primeros descendientes prekommitirovannyh. En particular, la introducción de células madre hematopoyéticas autólogas y pacientes de cáncer después de la quimioterapia MSCs por alta acelera la recuperación de los neutrófilos y plaquetas en la sangre periférica. Autólogo y trasplante alogénico de células madre mesenquimales que se utilizan para tratar el mieloma múltiple, anemia aplásica, trombocitopenia espontánea - enfermedades asociadas con defecto primario tejido estromal hematopoyético. La eficiencia de la terapia celular en patologías hematológicas en muchos casos anteriores, mientras que la introducción de estroma y células madre hemopoyéticas, que se manifestó una reducción del período de recuperación postoperatorio, sangre, disminución en el número de muertes debido a las células de cáncer regionales y circulantes de destrucción no selectivos en el que la matriz y sus células del paciente hematopoyético propia progenitoras. MSCs prometedoras aplicaciones y otras células precursoras mesenquimatosas multipotentes en la práctica clínica debido a su relativa facilidad de obtención de aspirados de médula ósea, la expansión en cultivo y la transfección del gen terapéutico. Así, para compensar los defectos tisulares locales pueden utilizar una implantación local de células precursoras mesenquimatosas multipotentes y en la disfunción sistémica de los tejidos de origen mesenquimatoso no se excluye su introducción en la circulación general.

Más cauteloso en sus argumentos de los autores de obras en las que las perspectivas de MSCs para, el trasplante sistémica local y la terapia génica se analizan desde el punto de vista de las células estromales de la biología. La médula ósea posnatal se considera tradicionalmente como un órgano que consiste en dos sistemas principales de líneas celulares claramente expresadas: el tejido hematopoyético real y el estroma de soporte asociado. Por lo tanto, las células madre mesenquimales de la médula ósea se consideraron inicialmente únicamente como una fuente de tallo estromal para la producción de factores reguladores en el microambiente hematopoyético. Luego, la atención de los investigadores pasó a estudiar el papel de MSC como una fuente madre de tejidos esqueléticos. Los últimos datos indican un potencial inesperado de diferenciación de las células del estroma de la médula ósea con la formación de un tejido neural o muscular. En otras palabras, las células madre mesenquimales exhiben plasticidad transgermal, la capacidad de diferenciarse en tipos celulares que no están fenotípicamente relacionados con las células del tejido original. Sin embargo, algunos aspectos de la biología de las células estromales de médula ósea siguen sin estar claros y sin resolver en el plan biológica general, y en algún detalle, incluyendo la identificación, de la naturaleza, el origen y el desarrollo y la función en las células estromales de médula ósea in vivo, así como el potencial de diferenciación permisible ex vivo y la posibilidad uso terapéutico in vivo. Los datos obtenidos sobre las capacidades potenciales de las MSC, así como los resultados de la investigación sobre el potencial regenerativo de otras células madre, están en aguda contradicción con los dogmas establecidos en biología.

Cuando se cultivan en condiciones de baja densidad, las células del estroma del tallo de la médula ósea forman colonias distintas, cada una de las cuales es un derivado de una sola célula precursora. El porcentaje de células progenitoras estromales en células nucleadas de médula ósea, determinadas por la capacidad de formar colonias, depende significativamente tanto de las condiciones de cultivo como de las especies que pertenecen al MSC. Por ejemplo, en el roedor para obtener la máxima cantidad de células progenitoras estromales es absolutamente necesario, en presencia de la cultura alimentador irradiada de células de médula ósea y suero, mientras que la formación de colonias eficiencia de las células madre mesenquimatosas humanas es independiente de la alimentación, o del medio de cultivo. El número de factores mitogénicos conocidos que estimulan la proliferación de células progenitoras del estroma es limitado. Estos incluyen PDGF, EGF, FGF, TGF-b y también IGF1. En condiciones de cultivo óptimas, las líneas policlonales de MSC sobreviven in vitro a más de 50 divisiones celulares, lo que permite obtener miles de millones de células del estroma de médula ósea a partir de 1 ml de su aspirado.

Sin embargo, la población de células estromales de médula ósea es heterogénea, que se manifiesta como la variabilidad en el tamaño de las colonias, diferente velocidad de su formación y una variedad de morfología celular, que abarca un rango de husillo similar a fibroblastos a las células planas grandes. Con el desarrollo de tales cultivos después de 20 días, también se observa heterogeneidad fenotípica. Parte de la colonia se caracteriza por una alta expresión de la fosfatasa alcalina, otros no lo expresan, y la tercera colonias de tipo son fosfatazopozitivnymi en la región central y fosfatazonegativnymi en la periferia. Las colonias separadas forman nódulos de tejido óseo (el comienzo de la mineralización de la matriz se marca cuando se tiñe con rojo de alizarina o con calcio por Van-Koss). En otras colonias, tiene lugar la acumulación de grasa, identificada por tinción G con aceite rojo. Con menor frecuencia, las colonias de las células madre mesenquimales forman cartílagos que se colorean con azul de alciano).

Después del trasplante ectópico en animales de experimentación líneas MGK policlonales forman estroma hueso ectópico con setchatoobraznoy asociado con la mielopoyesis y adipocitos, así, pero rara vez, con el tejido del cartílago. En líneas monoclonal trasplante de células estromales de médula ósea en algunos casos hay quimerismo, en el que la de novo de tejido óseo formado se compone de células óseas, adipocitos comprende origen estroma y del donante, mientras que las líneas celulares de hematopoyético y el sistema vascular se derivan del receptor.

Los resultados de estos estudios confirman la naturaleza del tallo del precursor de la médula ósea del estroma, a partir del cual se obtuvo la línea clonal. También muestran simultáneamente que no todas las clonaciones en células de cultivo realmente son células madre multipotentes. Algunos investigadores creen, y que comparten su opinión, que la información más precisa sobre el verdadero potencial de diferenciación de los clones individuales sólo se puede obtener in vivo después del trasplante, en lugar de mediante la determinación del fenotipo de sus derivados in vitro. Expresión de los marcadores fenotípicos cultura osteo- hondro- o la adipogénesis (determinado por ARNm o por medio de técnicas histoquímicas), e incluso la producción de matriz mineralizada no refleja el grado de pluripotencia solo clon in vivo. Por lo tanto, la identificación de células madre en el grupo de células estromales solo es posible a posteriori, en las condiciones adecuadas de una prueba de trasplante biológico. En particular, la condrogénesis muy raramente observada en los sistemas abiertos de trasplante, mientras que la formación de cartílago no es infrecuente en los sistemas cerrados, tales como cámaras de difusión o en cultivos mikromassnyh de las células del estroma in vitro, en el que alcanza la tensión localmente bajo oxígeno, contribuir a la formación de cartílago. Por lo tanto, incluso la técnica de trasplante, así como las condiciones de cultivo in vitro no específicas, afectan significativamente el rango de diferenciación de MSC.

El trasplante experimental con la observación de las condiciones experimentales dadas es el estándar de oro para determinar el potencial de diferenciación de las células del estroma de la médula ósea y el elemento clave de su identificación adecuada. Históricamente, los estudios de trasplante de médula ósea estromal de médula ósea están asociados con un problema común de trasplante de médula ósea. Se estableció que el microambiente hematopoyético se crea mediante el trasplante de células del estroma de la médula ósea y proporciona el desarrollo ectópico del tejido hematopoyético en la zona de trasplante. El origen del microambiente del donante y del tejido hematopoyético, del huésped, nos permite tratar el hueso ectópico como un verdadero trasplante de médula ósea "invertida". El trasplante local de células del estroma de la médula ósea promueve la corrección efectiva de los defectos óseos, más pronunciada que en la regeneración reparadora espontánea. Varios estudios preclínicos en modelos experimentales han demostrado convincentemente la posibilidad de utilizar trasplantes de médula ósea del estroma de médula ósea en ortopedia, aunque se necesita el trabajo y el análisis más exhaustivos para optimizar estas técnicas, incluso en los casos más simples. En particular, aún no se han establecido las condiciones óptimas para la expansión de células estromales osteogénicas ex vivo, la estructura y la composición del vehículo ideal permanecen sin usarse, así como también el número de células necesarias para la regeneración de hueso a granel.

Además de la aplicación de células estromales de médula propagadas ex vivo de hueso para la regeneración de tejidos de origen mesenquimatoso MSC ductilidad poco ortodoxo abre el uso potencial para la regeneración de las células neuronales, o la entrega de los productos génicos en el SNC. En principio, esto simplifica la terapia celular en la derrota del sistema nervioso, ya que no hay necesidad de obtener células madre neurales autólogas de los seres humanos. Se informa sobre las posibilidades de usar células de médula ósea para la generación de cardiomiocitos y células precursoras miogénicas como un origen verdaderamente estromal y extrínseco.

Se están llevando a cabo experimentos sobre el trasplante sistémico de células del estroma de la médula ósea para el tratamiento de enfermedades esqueléticas comunes. No hay duda de que las células estromales de la médula ósea son una población responsable de trastornos genéticos en enfermedades del esqueleto, que está bien ilustrado por el vector de transferencia mediante el uso de la información genética de las células, lo que conduce a la formación de tejido óseo patológico en animales de experimentación. Sin embargo, la capacidad de las células del estroma para implantarse, crecer, multiplicarse y diferenciarse en los huesos del esqueleto después de la introducción en el torrente sanguíneo general aún no se ha demostrado.

Esto es debido en parte al hecho de que el procedimiento estándar de estroma de médula ósea no se trasplantan con el tejido hematopoyético, criterios tan estrictos para evaluar el injerto con éxito de forma sistémica la administración de células estromales aún no se han desarrollado. Debe recordarse que la presencia de genes marcadores en extractos de tejidos o el aislamiento en el cultivo de células de origen donante no indica sobre el injerto de células, sino solo su supervivencia. Incluso inyección intra-arterial de las células estromales de médula ósea en la extremidad del ratón puede conducir a prácticamente el injerto resultado cero, a pesar del hecho de que las células derivadas del donante se encuentran en grandes números dentro de la red de médula ósea microvascular. Desafortunadamente, tales células se describen usualmente como "injertadas" solo sobre la base de los resultados de la determinación de los genes del donador marcador en condiciones de cultivo ex vivo. Además, es necesario proporcionar pruebas convincentes de la integración a largo plazo en los tejidos de células diferenciadas y funcionalmente activas de origen donante. En muchos trabajos publicados, donde se informa sobre el injerto de células del estroma de la médula ósea en el esqueleto, la falta de datos claros de este tipo es sorprendente. No obstante, debe observarse que en algunos experimentos correctos en animales, sin embargo, se ha establecido un injerto limitado pero real de células progenitoras del estroma después de su administración sistémica.

Estos datos son consistentes con los resultados del estudio de la posibilidad de suministrar células precursoras de médula ósea miogénica a los músculos a través del sistema vascular. Sin embargo, no debe olvidarse que tanto los músculos esqueléticos como los musculares se forman durante el desarrollo y el crecimiento en base a movimientos celulares extravasculares que utilizan procesos de migración que no implican la circulación en la sangre. Si realmente existe una vía circulatoria independiente para el suministro de células precursoras a tejidos en fase sólida, ¿es posible permitir la existencia de células progenitoras mesenquimatosas de circulación fisiológica? ¿Cuál es el origen de estas células tanto en el organismo en desarrollo como en el posnatal, y cómo penetran en la pared vascular? La solución de estos problemas es absolutamente necesaria y requiere el análisis preclínico más exhaustivo. Incluso después de encontrar las respuestas a estas preguntas, los aspectos cinéticos problemáticos asociados con el crecimiento esquelético y la remodelación del tejido conectivo quedan sin resolver. Al mismo tiempo, el tratamiento de los trastornos de la osteogénesis mediante el reemplazo de toda la población de células progenitoras esqueléticas mutadas con células estromales sanas parece ser una perspectiva clínica real. En este caso, las zonas locales de fractura o deformación debidas a la osteogénesis patológica, así como los cambios destructivos en el tejido óseo, pueden corregirse mediante células madre estromales in vitro cultivadas. Por lo tanto, la dirección de la investigación futura debería centrarse en los problemas de transformación o corrección genética de células progenitoras osteógenas mutadas autólogas ex vivo.

La ingeniería genética de las células, a corto plazo o permanente, se ha convertido en la base de la biología celular y molecular, la fuente de muchos descubrimientos científicos sobre el papel de las proteínas individuales en el metabolismo celular in vitro e in vivo. El uso de técnicas moleculares para corregir enfermedades hereditarias y enfermedades humanas es muy prometedor para la medicina práctica, ya que las propiedades de las células madre de médula ósea del estroma les permite desarrollar único trasplante de circuitos para la corrección de enfermedades genéticas del esqueleto. Al mismo tiempo, las células progenitoras mesenquimales pueden obtenerse fácilmente del futuro receptor, son susceptibles de manipulación genética y pueden multiplicarse en grandes cantidades en un corto período de tiempo. El uso de células madre mesenquimales evita las limitaciones y los riesgos asociados con la entrega de material de información genética directamente al paciente a través de estructuras de vectores vtruvous. Tal estrategia es aplicable pi a células madre embrionarias, sin embargo, las células estromales de médula ósea autólogas son el material más preferido, ya que su administración excluye posibles complicaciones inmunológicas postrasplante. Con el fin de lograr un efecto a corto plazo, por ejemplo con el fin de acelerar la regeneración de hueso, el método óptimo es la modificación genética de células madre mesenquimales utilizando elektroporatsrsh, fusión química, lipofección, plásmidos y construcciones adenovirales. En particular, la transfección viral en células estromales de médula ósea BMP-2 fue efectiva para acelerar la regeneración de huesos en el politrauma experimental. La creación de estructuras vectoriales adenovirales es preferible debido a la ausencia de toxicidad. Sin embargo, la modificación genética de las células del estroma de la médula ósea en este caso se caracteriza por una estabilidad extremadamente baja. Además, las células del estroma de médula ósea transformadas normales requieren el uso de vectores portadores de información genética 10 veces más infecciosos que otros tipos de células, lo que aumenta significativamente el porcentaje de muerte de las células transfectadas.

Para el tratamiento de enfermedades recesivas causadas por la actividad baja o biológica cero de ciertos genes necesarios de modificación prolongado o permanente de las células madre mesenquimales, que requiere el uso de virus adeno-asociados, retrovirus, lentivirus y quimera adeno-retroviral. Los sitios de transporte de estos virus son capaces de transportar grandes transcripciones de ADN (hasta 8 kb). La literatura científica ha aparecido ya información sobre la actividad biológica de las células exógenas de médula ósea estromales transfectadas con construcciones retrovirales que codifica la síntesis de moléculas reguladoras, y marcadores - IL-3, CD2, factor VIII, y las enzimas involucradas en la síntesis de L-DOPA. Pero en estos trabajos los autores señalan una serie de limitaciones que deben superarse antes de que comience la aplicación práctica de esta tecnología. El primer problema es optimizar el proceso de modificación MCK ex vivo. Se sabe que una proliferación prolongada (3-4 semanas) de las células del estroma de la médula ósea in vitro reduce su transfección. Al mismo tiempo, se requieren varios ciclos de transfusión para lograr un alto nivel de modificación genética de las MSC. El segundo problema está relacionado con la duración de la expresión del gen terapéutico, que aún no supera los cuatro meses. Una disminución natural en la expresión génica efectiva se debe a la inactivación de los promotores y la muerte de las células modificadas. En la transferencia perspectivas general de la información genética mediante el uso de células madre mesenquimales resultados de los estudios preliminares indican la necesidad de una mayor optimización de los métodos de transfección ex vivo, la selección de un promotor adecuado regulación de la actividad biológica en la dirección correcta, y mejorar la capacidad de las células estromales de médula ósea modificadas de auto-renovación in vivo después del trasplante. Cabe señalar que el uso de construcciones retrovirales para la modificación de las células del estroma de la médula ósea en la dirección deseada no siempre requiere su injerto obligatorio. De células madre mesenquimales transfectadas puede realizar una función correctiva en el fondo de estable y residencia sin requerir la incorporación física activa y funcionando en el tejido conectivo. En este caso, deben ser considerados como una mini-bomba biológica, produciendo en el factor vivo, la falta de los cuales determina la manifestación de una enfermedad genética.

El uso de células estromales de médula ósea transformadas para el tratamiento de la enfermedad genética dominante que se caracteriza por la expresión del gen o actividad biológica patológica anormal, es mucho más problemática debido a que en este caso es necesario bloquear la transferencia o venta de la información genética distorsionada. Uno de los métodos de ingeniería genética es la recombinación homóloga de células madre embrionarias para crear animales transgénicos. Sin embargo, el nivel extremadamente bajo de recombinante homólogo, combinado con los problemas de la identificación, separación y la expansión de dichos recombinantes es poco probable para promover el uso generalizado de esta técnica en un futuro próximo, incluso si el desarrollo de nuevos métodos tecnológicos. El segundo enfoque para la terapia génica se basa en la patología corrección automática dominante de ADN dañado como mutaciones genéticas pueden ser corregidos por la introducción del ADN exógeno con la secuencia deseada (oligonucleótidos de ADN cortos, o oligonucleótidos de ARN / ADN quiméricos) que se unen a los homólogos en el genoma dañado. La tercera realización proporciona bloqueo de la transmisión de información patológica que se consigue mediante el uso de oligonucleótidos diseñados específicamente que se unen a un gen particular para formar estructura helicoidal ternario, que excluye la posibilidad de la transcripción.

Aunque la corrección de enfermedades genéticas en el nivel del genoma es óptima y método terapéutico preferido, el ARNm es también un vector prometedor (tal vez incluso más accesible) para el bloqueo de un gen dominante negativo. Con el fin de inhibir la traducción y / o el aumento de la degradación del mRNA han sido utilizados con moléculas de proteína secuencias de oligonucleótidos antisentido o unión de aparato biosintético de mRNA de la célula de bloqueo completo. Además, el ARN bicatenario induce una rápida degradación del ARNm, cuyo mecanismo permanece poco claro. Sin embargo, es poco probable que la simple eliminación del ARNm transcrito a partir de un alelo mutante con mutaciones cortas o individuales promoverá la expresión del ARNm del alelo normal. Una alternativa es el uso de martillo ribozinov y horquilla, tener la capacidad de unirse a los sitios altamente específicas de mRNA con la posterior inducción de su escisión y la inactivación durante la traducción. Actualmente, se estudia la posibilidad de utilizar este método en el tratamiento de la osteogénesis patológica. Independientemente de lo que es exactamente el objetivo - elementos genómicos o citoplasmáticos éxito de la nueva tecnología de terapia génica será determinado por la eficiencia de la inclusión de los reactivos en las células estromales de médula ósea ex vivo, la elección óptima de un vector particular y la capacidad estable de células madre mesenquimales que expresan los factores deseados en vivo.

Por lo tanto, el descubrimiento de células madre mesenquimales con sus propiedades inesperadas crea un nuevo esquema conceptual para el desarrollo de líneas celulares. Pero para entender la función biológica de las células madre del estroma, de su naturaleza, la capacidad de transdiferenciación o desdiferenciación, su importancia fisiológica en el proceso de desarrollo embrionario, el crecimiento postnatal, maduración y envejecimiento, así como en enfermedades humanas requiere más investigación interdisciplinaria.


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