Un vial, dos objetivos: diagnóstico portátil de tuberculosis basado en CRISPR con una sensibilidad del 100 %

Un artículo sobre una prueba portátil de tuberculosis que puede realizarse directamente a partir del esputo, sin equipo complejo, fue publicado en Science Advances. La amplificación isotérmica de ADN y la lectura CRISPR se combinan en un solo tubo de ensayo; dos inserciones conservadoras de M. tuberculosis (IS6110 e IS1081) se prueban a la vez, más un gen humano como control de muestra interno. En una pequeña prueba "ciega" en muestras clínicas, la prueba dio 100% de sensibilidad (6/6) y 100% de especificidad (7/7) en comparación con el cultivo; el límite de detección es ~69–81 UFC/ml en esputo simulado. El resultado puede verse en una tira de prueba de papel y los reactivos están liofilizados (almacenamiento sin una "cadena de frío").

Fondo

Según la OMS, la tuberculosis causará la muerte de aproximadamente 1,25 millones de personas en 2023. La tuberculosis se ha convertido una vez más en la principal causa infecciosa de muerte, con un estimado de 10,8 millones de casos. Esto hace que el diagnóstico rápido y accesible sea crucial, especialmente en entornos con recursos limitados.

• Las pruebas actuales buscan un equilibrio entre precisión, velocidad y precio. El cultivo, el estándar de oro, es muy preciso, pero lento; la microscopía es rápida, pero insensible; las plataformas de PCR como Xpert MTB/RIF Ultra son significativamente más sensibles (LOD ≈ 15,6 UFC/ml), pero requieren equipos y cartuchos costosos, lo que limita la cobertura.
• ¿Por qué isotérmico y CRISPR? La amplificación isotérmica mediante RPA funciona a 37-42 °C y no requiere termocicladores, lo que resulta práctico en campo. La lectura CRISPR (Cas12/13) añade especificidad de especie y permite el flujo lateral visual («tira») sin necesidad de ópticas complejas. En definitiva, esta es la vía hacia pruebas de PVR portátiles y económicas.
• ¿Por qué dos dianas MBT simultáneamente (IS6110 + IS1081)? IS6110 es un inserto multicopia del complejo M. tuberculosis, pero algunas líneas tienen pocas copias, y las pruebas para IS6110 solo pueden fallar. Añadir un segundo inserto IS1081 reduce el riesgo de resultados falsos negativos.
• ¿Por qué usar control humano interno? Las muestras de aliento pueden contener inhibidores y muestras "malas". El control humano endógeno (p. ej., ARNasa P/ADN genómico) confirma que el material es adecuado y que la reacción no se suprime; de lo contrario, el resultado no puede considerarse negativo.
• El formato de un solo recipiente es importante en sí mismo. Reduce los pasos, disminuye el riesgo de contaminación y facilita el trabajo fuera del laboratorio. Estos enfoques para la tuberculosis ya han demostrado su viabilidad; el nuevo trabajo amplía la idea a un formato de doble diana con controles internos, además de demostrar la liofilización de reactivos y un lector de tiras.
• ¿Cuál es el valor de este artículo? Los autores demostraron la detección directamente en el esputo tras la preparación de muestra más simplificada, un límite de detección de ~70-80 UFC/ml en esputo simulado y una sensibilidad/especificidad del 100 % en un conjunto pequeño ciego de muestras clínicas: una buena demostración técnica para futuras validaciones multicéntricas.

Cómo funciona esto

• Los científicos combinaron la RPA (amplificación isotérmica rápida de material genético a 37 °C) con las enzimas de corte Cas13a/Cas12a. Tras seleccionar los ARN guía, configuraron el sistema para que actuara sobre dos dianas de MBT simultáneamente y en paralelo con el ADN humano (verificando que la muestra contuviera material y que la reacción no se hubiera estancado).
• Toda la química va en un tubo de ensayo; después de la incubación, el resultado se lee con un fluorímetro o en una tira de flujo lateral, esencialmente como una prueba exprés.
• El procesamiento del esputo se ha simplificado mediante calentamiento y una centrifugación breve, sin extractores de ácidos nucleicos. Para las condiciones más limitadas, los autores incluso consideran alternativas manuales a la centrifugación.

Lo que mostraron las pruebas

• Límite de detección: 69,0 UFC/ml (cepa H37Rv) y 80,5 UFC/ml (BCG) en esputo de la cepa "spike". No se detectó reactividad cruzada con otras bacterias/hongos.
• Entorno clínico (muestras enmascaradas): en 13 muestras de práctica real: 100 % de sensibilidad (6/6) y 100 % de especificidad (7/7) con respecto a la siembra. A modo de comparación, con el mismo kit, GeneXpert Ultra mostró 100 % y 86 %, respectivamente.
• Matices técnicos: De las dos opciones de lectura, Cas13a funcionó mejor (para el formato "one-pot", es más sensible que Cas12a). Además, el análisis paralelo de dos dianas de Mtb reduce el riesgo de resultados falsos.

¿Por qué es esto necesario?

Las pruebas actuales buscan un equilibrio entre precisión, velocidad y disponibilidad: el cultivo es muy preciso, pero lento; los hisopos son rápidos, pero imprecisos; los sistemas de PCR como GeneXpert son precisos y rápidos, pero requieren instrumentos y cartuchos costosos. El nuevo enfoque CRISPR busca cerrar esta brecha: diagnósticos de campo que funcionan a 37 °C, con lecturas en tiras de papel y la posibilidad de almacenar reactivos sin refrigeración.

Limitaciones y qué sigue

Esta es una demostración temprana en un pequeño conjunto clínico; se requieren pruebas multicéntricas de gran tamaño (incluyendo coinfección por VIH en niños, con formas paucibacilares y diferentes líneas de MBT). Los autores señalan por separado que, en la versión de campo, la centrífuga de sobremesa deberá sustituirse por una solución totalmente manual. Sin embargo, la arquitectura en sí —«dos dianas + control interno» en un solo tubo de ensayo— ya ha demostrado su operatividad y ofrece una vía clara para su perfeccionamiento para uso masivo.

Fuente: Alexandra G. Bell et al. Una prueba simplificada basada en CRISPR para la detección de tuberculosis directamente en el esputo, Science Advances, en línea, 6 de agosto de 2025 (Vol. 11, Número 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206